四跨膜蛋白TSPAN9抑制5-FU诱导的胃癌SGC7901细胞凋亡及机制研究

摘要

背景及目的：　　胃癌5年生存率仅占20％左右。Tetraspanins是一类四跨膜蛋白超家族，在细胞中发挥着信号转导、增殖、运动、粘附、免疫应答等多种生物学功能。TSPAN9是四跨膜蛋白超家族成员中的一员，我们前期研究观察到，TSPAN9在耐药胃癌样品中表达水平增加，TSPAN9的高表达与胃恶性肿瘤不良预后有关，但具体分子机制尚不清楚。本研究拟在体外细胞水平上，探讨和研究高表达的TSPAN9对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响及可能的作用机制。　　方法：　　构建携带TSPAN9基因及空载体的重组质粒，根据LIP3000说明书，将构建好的携带TSPAN9基因及空载体的重组质粒，转染至胃癌细胞株SGC7901细胞中，从而分成TSPAN9过表达转染组及空载体组，同时培养SGC7901（空白组）。即SGC7901/TSPAN9（转染组）、SGC7901/NC（对照组）、SGC7901（空白组）。转染6小时后，分别给予亚毒性剂量的5-FU（10 μg/mL），继续培养，24h或48h后收集细胞，分别提取RNA、蛋白质。应用qRT-PCR和Western-Blot技术分别在mRNA及蛋白水平验证TSPAN9过表达、检测细胞中促凋亡指标（Bax、Caspase-3）、抑凋亡指标（Bcl-2、Mcl-1）以及通路蛋白（β-catenin、GSK-3β、Axin1、Dvl2）。应用流式细胞术检测细胞早期及晚期凋亡情况。　　结果：　　SGC7901/TSPAN9转染组TSPAN9在mRNA及蛋白质水平均高表达。在10μg/mL 5-FU干预条件下，qRT-PCR和Western-Blot实验中，SGC7901/TSPAN9转染组促凋亡指标（Bax、Caspase-3）明显降低，抑凋亡指标（Bcl-2、 Mcl-1）明显升高，同时在流式细胞术实验中，与对照组相比较，SGC7901/TSPAN9组细胞总凋亡率明显降低。在通路机制研究中，TSPAN9组Wnt通路相关蛋白（β-catenin、GSK-3β、Axin1、 Dvl2）也是明显升高的，P＜0.05。　　结论：　　在胃癌细胞中，过表达的TSPAN9激活Wnt/β-catenin信号通路，通过调节与凋亡增殖（Bcl-2、Bax、Caspase-3、Mcl-1）相关指标中Bcl-2、Mcl-1的上调，以及下调Bax、Caspase-3，进而参与调控胃癌细胞的凋亡，降低胃癌细胞株SGC7901细胞对5-FU的敏感性，使细胞产生耐药，最终影响胃癌的发展。

目录

引言

材料与方法

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 主要试剂

1.3主要仪器

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 TSPAN9质粒合成和提取

2.3 细胞转染

2.4 Western Blot

2.5实时荧光定量PCR

2.6 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡

2.7 统计分析

结果

1.转染TSPAN9基因后SGC7901/5-FU细胞内TSPAN9过表达验证

2.TSPAN9过表达SGC7901/5-FU细胞凋亡率变化

3.TSPAN9过表达对Bax、Caspase-3、Bcl-2 在mRNA表达水平的影响

4.TSPAN9过表达对Bax、Caspase-3、Bcl-2、β-catenin在蛋白水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述:Tetraspanin家族与肿瘤多药耐的研究现状

综述参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢

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