人脐带间充质干细胞外泌体对阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠心肌微血管及心功能的影响

摘要

目的：　　探讨通过尾静脉移植方式研究人脐带间充质干细胞外泌体对扩张型心肌病模型大鼠心肌微血管再生及心功能恢复的影响。　　方法：　　1. 构建扩张型心肌病（DCM）大鼠模型并鉴定　　采用六周龄左右的雄性SD大鼠140只，随机分为正常组对照组（n=20）和扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy ，DCM）模型组（n=120）。DCM模型组大鼠采用每周腹腔注射阿霉素1.0mg/kg，每周2次，连续8周的方法构建DCM模型。注射药物1周后，行超声心动图来检测评价大鼠心功能，免疫组化标记心肌组织CD34，计算微血管密度，同时行心肌组织HE及Masson染色。　　2. 人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells，hUCMSCs）外泌体（exosome）的提取及鉴定运用组织块法原代培养hUCMSCs，采用传代培养的第3代hUCMSCs行流式细胞仪鉴定干细胞表面标志物；收集3-5代的hUCMSCs无血清培养基，，试剂盒法提取外泌体；应用透射电子显微镜观察获取的外泌体（exosomes）形态；蛋白免疫印迹法（western blot)检测人脐带间充质干细胞（hUCMSCs-exo）的特异性表面标志蛋白CD81和CD9，及采用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）鉴定提取的外泌体。　　3. 尾静脉注射人脐带间充质干细胞外泌体（hUCMSCs-exo）对DCM大鼠心肌微血管及心功能的影响　　将建模成功后的DCM大鼠随机分为4组：hUCMSCs-exo低剂量组（n=16）、hUCMSCs-exo中剂量组（n=16）、hUCMSCs-exo高剂量组（n=16）及DCM模型对照组（n=16）。分别经尾静脉注射低剂量（20 μg/kg）、中剂量（100 μg/kg)、高剂量（250 μg/kg）的外泌体及PBS(1 ml/kg），每周1次，连续注射4周。治疗前、治疗2周后、4周后分别行心脏超声检测心功能。治疗4周后处死全部大鼠，取大鼠心肌组织，免疫组化标记CD34，计算微血管密度,Western blot检测各组心肌组织血管内皮细胞生长因子受体2（VEGF-2）的表达情况；透射电镜检测心肌微血管结构改变，同时行HE及Masson染色。　　结果：　　1. DCM大鼠模型建造结果　　可观察到DCM建模成功的大鼠的心脏超声心动图显示大鼠心室腔扩大，室壁整体运动不协调，活动度弥漫性减弱。在建模过程中可发现该模型组大鼠出现逐渐心衰表现，例如大鼠进食差，活动量减少，逐渐消瘦，脱毛，腹涨，四肢水肿。超声心动图的实验数据显示DCM大鼠的LVESD、 LVEDD较正常对照组大鼠明显增大（P＜0.01），LVFS、LVEF较正常组大鼠显著降低（P＜0.01）。DCM组大鼠心肌组织Masson染色可观察到心肌组织内较多的蓝染的胶原纤维组织；模型组大鼠心肌HE染色示心肌纤维排列较正常组大鼠心肌组织纤维紊乱，可观察到部分心肌纤维断裂，同时能观察到水肿的心肌细胞及间质，大量的坏死聚集成灶状的炎症淋巴细胞。　　2. 脐带间充质干细胞与其外泌体的鉴定　　显微镜下可观察到P3代的hUCMSCs贴壁呈梭形生长，经流式细胞仪检测hUCMSCs高表达特异性免疫分子CD73、CD90，低表达CD34、CD45；外泌体样本经透射电子显微镜可观察到直径40-150nm的圆形或者椭圆形小囊泡；Western blot可检测到外泌体表面特异性表达蛋白CD81和CD9。　　3. 探讨尾静脉注射人脐带间充质干细胞外泌体（hUCMSCs-exo）对DCM大鼠心功能及心肌微血管的影响　　尾静脉注射hUCMSCs-exo后的剂量组大鼠生存率提高，腹水、四肢水肿的心衰症状都较正常对照组改善。治疗14天，剂量组干预的DCM 大鼠心功能指标LVFS、LVEF较前有所改善。外泌体干预28天后，LVFS、LVEF较干预前及DCM对照组均显著升高（P＜0.05），但是剂量组之间无明显差异（P>0.05）, hUCMSCs-exo剂量组大鼠心肌增生的微血管密度较DCM对照组增多（P＜0.05）;Western blot蛋白印迹检测显示外泌体干预的DCM剂量组大鼠心肌组织高表达VEGF-2；电镜下心肌微血管内皮损伤程度明显减轻。　　结论：　　1. 采用大鼠小剂量分次腹腔注射阿霉素，能够构建与临床DCM病理机制相似的大鼠DCM模型，用于下一步实验。　　2. 通过尾静脉注射hUCMSCs-exo可调节DCM大鼠心肌微血管增生过程，保障心肌细胞功能，改善心脏功能。证实了干细胞的旁分泌机制，但是不同剂量的外泌体之间未见显著差异。

目录

引言

材料与方法

1实验材料

1.1实验动物

1.2脐带标本

1.3主要试剂

1.4 主要设备

2.实验步骤

2.1人脐带间充质干细胞的分离培养

2.2 hUCMSCs-exo的提取及鉴定

2.3DCM动物模型的建立

2.4hUCMSCs-exo

2.5统计结果分析

实验结果

1. 人脐带间充质干细胞的分离培养与鉴定

1.1hUCMSCs的培养

1.2 hUCMSCs的鉴定

2.hUCMSCs-exo的鉴定结果

3.SD大鼠DCM 建模后的情况

3.1建模过程中正常组大鼠与DCM组大鼠生存率变化。

3.2体质量变化

3.3. DCM大鼠与正常组大鼠超声心动图结果比较

3.4.HE及Masson染色结果

4.尾静脉注射hUCMSCs-exo对DCM大鼠心肌微血管及心功能的影响

4.1尾静脉注射hUMSCs-exo后大鼠的一般情况

4.2 hUCMSCs-exo移植后四组大鼠超声心动图的结果比较。

4.3尾静脉注射外泌体后大鼠心肌组织微血管的表达

4.4蛋白水平VEGF-2在hUCMSCs-exo移植后各组大鼠心肌的表达状况。

讨论

结论

参考文献

综述:间充质干细胞外泌体的研究现状

参考文献

攻读学位期间发表的论文

英文缩略词

致谢

声明