基于ISSR分子标记的南方红豆杉的遗传特征研究及其SSR文库的构建

摘要

南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)又称美丽红豆杉,为我国特有的第三纪孑遗植物,是红豆杉属(Taxus)中分布最广的植物种类之一。由于其含有抗癌活性成分紫杉醇,使其成为重要的药用植物。主要分布于长江流域以南各省区、南岭山脉山区以及河南、陕西、甘肃等省的山地或溪谷。本研究主要采用核基因简单重复序列区间(ISSR)分子标记,探讨南方红豆杉的遗传结构和遗传多样性,并构建了 SSR文库,旨在为制定南方红豆杉遗传保育策略并实施有效保护和利用提供理论依据。主要研究结果如下:
　　1.南方红豆杉ISSR分析结果
　　通过对11个省市20个南方红豆杉种群的320个个体的ISSR标记检测,结果显示:南方红豆杉在物种水平上:PPL为91.20％,Nei’s基因多样性为0.3331, Shannon′s信息指数为0.4954,在种群水平上:PPL为62.36%,Nei’s基因多样性为0.2189,Shannon′s信息指数为0.3264,种群和物种水平上均具有较高的遗传多样性,且种群水平遗传多样性低于物种总遗传多样性。同时,20个种群的物种总基因多样性(Ht)为0.3331,其中种群内平均遗传变异(Hs)为0.2189,Nei′s基因分化系数(Gst)为0.3428,即表明总的遗传变异中有34.28%来自于种群间,65.72%来自种群内,种群内的分化明显。分析认为:南方红豆杉的遗传多样性主要分布于种群内,原因可能与其生活史类型和交配系统有关。
　　根据Nei′s遗传距离进行UPGMA聚类分析,将南方红豆杉20个种群分成了两大支,该结果与先前研究的结论有差异。从整体和分组上对遗传距离和地理距离的相关性进行 Mantel检测发现:在整体物种水平上,遗传分化和地理距离呈中度相关(r2=0.2247, P<0.01);在分组水平上,第一组遗传分化和地理距离呈中度相关(r2=0.1840, P<0.01);第二组遗传分化和地理距离不具有相关性(r2=0.0955, P>0.05)。分析认为,南方红豆杉的分布区地形复杂,海拔差异大,分布地区有众多高山峡谷,南方红豆杉的基因流因此受到一定的阻碍,从而导致南方红豆杉种群的遗传分化和地理距离呈现中度相关性。
　　2.红豆杉属SSR引物在南方红豆杉中的应用
　　采用正交试验和单因素试验,建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。结果表明,南方红豆杉SSR-PCR反应的最优结果为15μL反应体系中模板 DNA为(50ng·μL-1)0.2μL, Mg2+为(25mM)1.2μL, dNTP为(10mM)0.1μL,引物为(10μM)0.2μL,Taq聚合酶为(5U·μL-1)0.1μL。
　　将红豆杉属植物中已公布的30对具多态性的微卫星位点的引物序列用于在南方红豆杉物种中进行转移扩增,实验结果表明:30对引物中仅1对能扩增出具有多态性的条带。由此得出,红豆杉属其他物种的SSR引物在南方红豆杉中的应用效率极低,其引物跨物种扩增不足以用于分析南方红豆杉的遗传多样性。
　　3.南方红豆杉微卫星富集文库的构建
　　本研究共筛选出224个阳性克隆,测序结果表明:其中189个克隆含有(CA)n、(AG)n等重复5次以上的微卫星序列片段,其中完全型92个,占48.7%;不完全型69个,占36.5%;复合型28个,占14.8%。南方红豆杉微卫星序列中的优势类型是(CA)n,此外还富集到了(GGC)n、(CACT)n、(GAGT)n、(ACAG)n等类型的微卫星。同时,南方红豆杉基因组还含有许多小的不连续的(TG)n,散在分布在100~200 bp的范围,这些富含(TG)n的区域即为TG岛,研究这些特殊结构的功能有着重要的意义。

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第一章 研究背景及现状

1 南方红豆杉生物学特点

1.1形态学

1.2种子休眠与萌发

1.3开花结实

1.4紫杉醇含量

2 南方红豆杉生境特征及资源现状

2.1地理分布

2.2适生条件

2.3物候特点

2.4群落特征

2.5资源现状

3 南方红豆杉分子生物学研究现状

4 本研究所采用的分子标记

4.1核基因ISSR标记

4.2核基因SSR标记

5本文的研究意义和目的

第二章 南方红豆杉遗传多样性的ISSR分析

1 实验材料

1.1样本的采集及保存

1.2主要实验仪器

2 实验方法

2.1 基因组DNA的提取

2.2 南方红豆杉ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选

2.3 电泳和成像

2.4数据统计与分析

3 实验结果

3.1. 南方红豆杉种群和物种水平上的遗传多样性

3.2 南方红豆杉种群间的遗传结构

3.3 南方红豆杉种群的聚类分析及遗传距离与地理距离的关系

3.4 南方红豆杉种群的Mantel 检验

4 结论与讨论

4.1南方红豆杉的遗传多样性和遗传结构

4.2南方红豆杉种群间的遗传分化

4.3南方红豆杉种群遗传结构和地理分布的关系

4.4小结

第三章 红豆杉属植物微卫星引物在南方红豆杉中的应用及南方红豆杉微卫星文库的建立

1 实验材料

1.1主要实验仪器

1.2实验试剂

2 实验方法

2.1南方红豆杉SSR-PCR体系的建立与优化

2.2 TP-M13-SSR技术应用于多态性微卫星位点的筛选

2.3南方红豆杉微卫星文库的构建

3 实验结果

3.1南方红豆杉SSR-PCR体系的建立与优化

3.2 红豆杉属植物SSR引物在南方红豆杉中的应用

3.3南方红豆杉微卫星文库的构建

4 结论与讨论

4.1 SSR-PCR反应体系的建立与优化

4.2 红豆杉属SSR引物的跨种扩增

4.3 南方红豆杉微卫星文库的建立

4.4 小结

参考文献

致谢