胃癌细胞系中组蛋白修饰与肿瘤相关基因沉默的关系

摘要

恶性肿瘤为多因素、多阶段形成，其发生机制在于细胞内部基因结构和功能发生了异常改变。现代肿瘤理论认为，在肿瘤的形成过程中包含两大类机制，一个是遗传学层面，即通过DNA核苷酸序列改变而形成突变；另一个就是表遗传学(epigenetics)层面，其研究的对象是基因表达的变化，这种变化可通过减数分裂遗传，但不涉及有关基因DNAJ芋列的改变。表遗传学尽管不存在DNA核苷酸序列的改变，但通过DNA自身化学修饰方式从转录水平影响基因的表达，调控DNA功能，此机制在肿瘤的形成过程中越来越受到重视。 肿瘤发生中的主要表遗传学改变是肿瘤抑制基因发生DNA高甲基化和染色质中的组蛋白修饰。DNA甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制，是一种酶介导的化学修饰过程，在DNA的某些碱基上增加一个甲基。目前已经明确肿瘤抑制基因启动子区CpG岛甲基化能抑制转录起始，导致基因沉默，在肿瘤的发生和发展中扮演着极其重要的角色。现已确切证明DNA甲基化是肿瘤抑制基因失活的第三种机制，而且在某些情况下是肿瘤抑制基因失活的唯一机制。 组蛋白位于核小体中央，并非只是一种包装蛋白，而是在DNA和其它细胞组分之间构筑了一个动态的功能界面。组蛋白在翻译完成后，其 N 端尾区会发生多种共价修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、糖基化等。组蛋白被修饰后染色体结构发生改变，细胞中催化组蛋白修饰的酶可将其所携带的信息传递给染色体调节因子，最终导致基因表达的改变。通常认为组蛋白的高乙酰化是活跃转录染色质的一个标志，而低乙酰化则与转录抑制有关。组蛋白H3K9(组蛋白H3中的第9位赖氨酸)甲基化是浓缩的失活的染色体标志，参与X-染色体失活和异 染色质形成，抑制基因表达，而组蛋白H3K4甲基化则对基因表达具有激活效应。 另外，研究表明组蛋白修饰与DNA甲基化之间存在着相互作用。在脉孢菌中，DNA甲基化可能是组蛋白甲基化的直接或间接结果。在结肠癌中，肿瘤抑制基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA甲基化正相关，而H3K4甲基化、H3K9乙酰化与之负相关。 在亚洲国家，胃癌是导致患者死亡的常见恶性肿瘤之一。肿瘤相关基因甲基化在胃癌的发生、发展过程中起重要作用，而研究组蛋白修饰对胃肠道恶性肿瘤相关基因表达调控的影响对于胃癌的发生、发展及治疗等方面也具有重要的意义。 实验方法： 一、实验对象 胃癌细胞系SGC-7901，MGC-803，BGC-823及MKN-45。 二、实验方法 1、细胞培养 SGC-7901，MGC-803，BGC-823及MKN-45按常规培养于含10％胎牛血清RPMI-1640的培养液，NaHCO2浓度2g/L，青霉素G浓度100U/L，链霉素浓度100μg/L，37℃含5％CO2的湿润空气的恒温密闭式培养箱培养。 2、实验分组 对照组：同期培养不加药的胃癌细胞系细胞； 实验组：(1) 5-Aza-dC组：5μmol/L 5-Aza-dC培养72小时； (2) TSA组：加TSA 300nmol/L培养24小时； (3) 5-Aza-dC及Tsh组：加5μmol/L 5-Aza-dC 48小时后加TSA 300nmol/L继续培养24小时。 3、引物设计 MSP、RT-PCR、ChIP引物序列和反应条件见表1-3。 4、甲基化特异性PCR法检测DNA甲基化水平 收集细胞，酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。紫外分光光度仪定性、定量。亚硫酸氢钠修饰DNA，wizard DNA Clean-up Systerm纯化。离心沉淀DNA。采用甲 基化特异性PCR方法，甲基化酶处理的和未处理的正常人的外周血细胞分别为阳性和阴性对照。PCR，琼脂糖凝胶电泳，genefinder染色。实验重复三次，取其平均值进行分析。 5、RT-PCR检测肿瘤抑制基因mRNA表达 收集细胞，TRIzol试剂提取总RNA，以Oligo dT为引物反转录合成cDNA(按试剂盒说明书进行)，然后以各基因引物进行PCR扩增，以GAPDH为内对照，以正常表达各基因的细胞作阳性对照。琼脂糖凝胶电泳，genefinder染色。以各基因与GAPDH条带的光密度比值作为分析指标，实验重复三次，取其平均值进行分析。 6、染色质免疫沉淀分析检测甲基化H3K9、乙酰化H3K9、甲基化H3K4水平 收集细胞，甲醛交联组蛋白和DNA。裂解缓冲液悬浮细胞，其中一部分作内对照，第二部分分别加H3K9乙酰化抗体、H3K9甲基化抗体、H3K4甲基化抗体，第三部分加正常兔IgG作阴性对照，收集抗体/蛋白复合物，分解交联物，酚/氯仿法提取DNA，应用寡核苷酸引物行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。以各基因与内对照条带的光密度比值作为分析指标，实验重复三次，取其平均值进行分析。 7、免疫杂交法检测H3总蛋白、H3K9甲基化蛋白、H3K9乙酰化蛋白、H3K4甲基化蛋白水平 提取蛋白，电泳，PVDF膜转膜，BSA封闭。分别加入H3、H3K4甲基化、H3K9甲基化、H3K9乙酰化抗体、actin兔单克隆抗体，然后加入单克隆二抗，成像，采集数据。采用条带密度值与相应actin密度值的比值作为指标进行比较，实验重复三次，取平均值进行分析。 实验结果： 1、基因mRNA表达随着其启动子区DNA甲基化水平增高而降低，即基因启动子区DNA甲基化水平越高，其mRNA表达水平越低。 2、p16、MLH1、MGMT、E-cadherin基因启动子区域组蛋白H3K9甲基化状态与DNA甲基化正相关，即DNA甲基化程度高者，H3K9甲基化程度也高；半甲基化 者，H3K9甲基化程度中等；无甲基化者，H3K9甲基化程度很低。 3、p16、MLH1、MGMT、E-cadherin基因启动子区域组蛋白H3K9乙酰化、H3K4甲基化状态与DNA甲基化负相关，即DNA甲基化程度高者，H3K9乙酰化、H3K4甲基化程度低；半甲基化者，H3K9乙酰化、H3K4甲基化程度中等；无甲基化者，H3K9乙酰化、H3K4甲基化程度高。 4、TSA对基因启动子区域组蛋白H3K9甲基化无影响，5-Aza-dC明显降低启动子区域H3K9甲基化程度(仅对存在半或甲基化的启动子区域)，联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。 5、5-Aza-dC对基因启动子区域组蛋白H3K4甲基化的作用与对启动子区域H3K9甲基化的作用恰好相反，5-Aza-dC明显提高沉默位点H3K4甲基化程度(仅对存在甲基化的启动子区域)，TSA对启动子区域H3K4甲基化无影响，联合给予5-Aza-dC和TSA与单独给予5-Aza-dC的作用相似。 6、TSA和5-Aza-dC对基因启动子区域组蛋白H3K9乙酰化的影响一致，均与启动子区CpG岛甲基化水平相关。启动子区CpG岛甲基化水平高，TSA和5-Aza-dC对启动子区域H3K9乙酰化有作用，中等程度提高启动子区域H3K9乙酰化程度；启动子区CpG岛半甲基化，TSA和5-Aza-dC对启动子区域H3K9乙酰化无或有轻度作用；启动子区CpG岛非甲基化，TSA和5-Aza-dC对启动子区域H3K9乙酰化无影响。然而，联合给予5-Aza-dC和TSA却不论启动子区CpG岛甲基化水平，明显提高启动子区域H3K9乙酰化程度。 7、单独给予5-Aza-dC和联合给予5-Aza-dC及TSA与的作用相似，能去除DNA甲基化，TSA不影响任何基因DNA甲基化。 8、5-Aza-dC可使沉默的基因重新表达，TSA对基因表达无影响， 5-Aza-dC及TSA可协同促进基因表达。 9、5-Aza-dC和TSA处理前后的H3总蛋白、甲基化H3K9蛋白、甲基化H3K4蛋白、乙酰化H3K9蛋白没有变化。 结论： 1、在胃癌细胞系中，p16、MLH1、MGMT、E-cadherin肿瘤相关基因启动子区CpG岛的甲基化与基因沉默相关，甲基化抑制剂可使甲基化的p16、MLH1、MGMT、 E-cadherin发生去甲基化，并使沉默的基因重新表达。 2、在胃癌细胞系中，p16、MLH1、MGMT、E-cadherin基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA甲基化正相关，而组蛋白H3K4甲基化和组蛋白H3K9乙酰化与DNA的甲基化负相关。基因启动子区组蛋白H3K9甲基化与DNA的甲基化在基因的沉默机制中具有协同作用，而组蛋白H3K4甲基化和H3K9乙酰化拮抗DNA甲基化所产生的基因沉默。 3、在胃癌细胞系中，甲基化抑制剂可影响p16、MLH1、MGMT、E-cadherin基因启动子区组蛋白H3K9甲基化、H3K4甲基化和H3K9乙酰化，而且与DNA甲基化状态相关。

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英文论著摘要

论文一：胃癌细胞系中肿瘤相关基因表达及DNA甲基化的关系

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二：胃癌细胞系中肿瘤相关基因启动子区域DNA甲基化与组蛋白修饰状态的关系

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三：胃癌细胞系中组蛋白修饰与肿瘤相关基因沉默的关系

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：组蛋白修饰与胃肠道恶性肿瘤的关系

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