免疫蛋白酶体亚基PSMB10参与血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心房颤动的机制研究

摘要

心房颤动（房颤）是常见的持续性的心律失常之一，心房颤动的发病率随着年龄的增长而升高。房颤患者心房内快速不规则的电活动导致心房收缩受损，增加心脏病的发病率及死亡率，更糟糕的是促进血栓形成及栓塞（如脑卒中）等并发症的发生，据文献报道，由房颤造成的栓塞高达15％。实验动物模型和人体研究表明，包括肾素-血管紧张素系统(RAS)和炎症在内的几种主要信号通路参与了房颤的发生。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要效应激素，在调节炎症反应、氧化应激和纤维化方面发挥着重要作用，这也是房颤的常见病理改变。越来越多的证据表明，AngⅡ发挥这些作用主要通过AT1受体和NF-kB、TGF-β信号通路的激活。相反，RAS的抑制减少了NF-kB、TGF-β介导的炎症和心房纤维化。　　泛素-蛋白酶体系统(UPS)在调节蛋白质质量控制和各种疾病中起着关键作用。26S蛋白水解复合物由20S蛋白酶体和19S调节亚基组成。20S核心在β-环内部具有三个标准催化亚基，即β1(PSMB6)、β2(PSMB7)和β5(PSMB5)。用干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子刺激会诱导β1i（PSMB9或LMP2）、β2i(PSMB10、MECL-1或LMP10)和β5i(PSMB8或LMP7)取代标准亚基形成新的20S免疫蛋白酶体。据报道，免疫蛋白酶体在控制免疫应答，氧化应激和维持细胞蛋白质稳态方面起着重要的作用。此外，免疫蛋白酶体比标准蛋白酶体能更有效地调节特定的细胞内信号传导途径，例如NF-kB信号传导。最近的研究表明，包括AngⅡ、高盐、异丙肾上腺素或压力超负荷在内的多种高血压刺激可显著增加心脏中标准和免疫蛋白酶体亚基的表达以及相应的蛋白水解活性，敲除PSMB10可以降低DOCA/盐处理的小鼠血压和心脏纤维化。然而，关于免疫蛋白酶体亚基PSMB10在调节血管紧张素Ⅱ诱导的房颤中的作用尚不完全清楚。　　目的:　　通过AngⅡ灌注小鼠房颤模型，检测小鼠心房纤维化、炎症、氧化应激、离子通道的改变，探索免疫蛋白酶体亚基PSMB10参与调节房颤发生的分子机制。同时研究IKK抑制剂IMD0354对房颤的影响及其分子机制。　　方法:　　运用AngⅡ持续微量灌注野生型C57BL/6小鼠(WT)、PSMB10基因敲除(PSMB10KO)小鼠和9型腺相关病毒-PSMB10转染（rAAV9-PSMB10）小鼠三周建立小鼠房颤模型，使用小鼠鼠尾套管血压监测血压，电生理检测仪测量小鼠诱发房颤发生率及持续时间，Masson染色检测心房纤维化程度，H&E、Mac-2染色检测心房炎性细胞浸润，DHE染色检测心房氧化应激，实时定量PCR检测胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、IL-1、IL-6、NOX-2和NOX-4的mRNA表达量对应评估心房纤维化、炎症、氧化应激水平，蛋白免疫印迹法检测小鼠心房PSMB10、离子通道、缝隙链接蛋白表达量及纤维化、炎症信号通路变化，ELSIA检测房颤患者血清PSMB10浓度，检测小鼠心房组织和血清以及房颤患者血清胰蛋白酶样活性，来研究免疫蛋白酶体亚基PSMB10参与调节房颤发生的分子机制。　　结果:　　1.经过三周的AngⅡ灌注，相比于生理盐水灌注组，心房中PSMB10蛋白及mRNA表达量明显增高，PSMB10对应的胰蛋白酶样活性增强。　　2.与对照组相比，房颤患者血清中PSMB10的浓度及胰蛋白酶样活性也显著增加。　　3.相比于生理盐水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠组房颤发生率及房颤持续时间显著增加，而AngⅡ处理的PSMB10基因敲除小鼠组发生率及房颤持续时间均减少。　　4.相比于生理盐水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠组心房纤维化水平、胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ表达明显增加，PSMB10基因敲除小鼠组的纤维化改变均较AngⅡ灌注的野生型小鼠组减轻。　　5.AngⅡ灌注可以减少小鼠心房中PTEN的表达，进而引起AKT1/TGF-β信号通路的激活，AngⅡ处理的PSMB10基因敲除小鼠组PTEN降解减少，AKT1/TGF-β信号通路的激活被抑制。　　6.相比于生理盐水灌注，AngⅡ灌注野生型小鼠组心房炎症、氧化应激水平明显增加，PSMB10基因敲除小鼠组的上述病理改变均较AngⅡ灌注的野生型小鼠组减轻。　　7.AngⅡ灌注引起小鼠心房缝隙链接蛋白43的蛋白表达水平增加，敲除PSMB10可以减少缝隙链接蛋白43的表达。　　8.AngⅡ灌注可以促进小鼠心房中IKKβ的激活和IkBα的泛素化降解，导致NF-kB信号通路的激活，AngⅡ处理的PSMB10基因敲除小鼠组IkBα降解减少，NF-kB信号通路的激活被抑制。　　9.相比于生理盐水灌注组，AngⅡ灌注rAAV9-GFP转染小鼠组房颤发生率及房颤持续时间显著增加，而AngⅡ处理的rAAV9-PSMB10转染小鼠组房颤发生率及持续时间均进一步增加。　　10.相比于AngⅡ处理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10转染小鼠组，IMD0354（IKKβ抑制剂）减少房颤持续时间。　　11.相比于生理盐水灌注，AngⅡ灌注rAAV9-GFP转染小鼠组心房纤维化明显增加，AngⅡ处理的rAAV9-P SMB10转染小鼠组的纤维化进一步增加。AngⅡ灌注可以显著引起rAAV9-GFP转染小鼠心房中PTEN的减少，进而引起AKT1-TGF-β-Smad2/3信号通路的激活，AngⅡ处理的rAAV9-PSMB10转染小鼠组PTEN的降解和AKT1-TGF-β-Smad2/3信号通路的激活进一步增加。　　12.相比于AngⅡ处理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10转染小鼠组，IMD0354对心房纤维化水平以及AKT1-TGF-β-Smad2/3信号通路没有影响。　　13.相比于生理盐水灌注组，AngⅡ灌注rAAV9-GFP转染小鼠组炎症、氧化应激、IL-1β、IL-6、NOX2和NOX4mRNA表达明显增加，AngⅡ处理的rAAV9-P SMB10转染小鼠组的上述改变进一步加重。AngⅡ灌注可以促进rAAV9-GFP转染小鼠心房中NKKβ的激活和IkBα的泛素化降解，导致NF-kB信号通路的激活，过表达PSMB10使IkBα降解以及NF-kB信号通路的激活进一步增强。　　14.相比于AngⅡ处理的rAAV9-GFP或rAAV9-PSMB10转染小鼠组，IMD0354降低心房炎性细胞浸润、IL-1β和IL-6mRNA表达，同时降低NF-kB信号通路的激活。　　15.AngⅡ灌注引起rAAV9-GFP转染小鼠心房缝隙链接蛋白43的蛋白表达增加，过表达PSMB10可以增强缝隙链接蛋白43的表达。IMD0354降低心房缝隙链接蛋白43的表达。　　结论:　　AngⅡ灌注小鼠房颤模型中，小鼠房颤发生率及房颤持续时间明显增多，心房组织纤维化、炎症、氧化应激水平明显增加，同时缝隙链接蛋白43的蛋白表达量上调。敲除PSMB10可以减轻上述现象。机制上，AngⅡ灌注引起PSMB10表达增多，促进PTEN的降解以及AKT1的激活，不仅促进TGF-β-Smad2/3信号通路的激活导致纤维化，同时还激活IKKβ和促进IkBα的泛素化降解，导致NF-kB目的基因（IL-1β、IL-6、NOX2、NOX4和CX43）上调。在第二部分中，AngⅡ灌注rAAV9-GFP转染小鼠房颤模型中，小鼠房颤发生率及房颤持续时间明显增多，心房组织纤维化、炎症、氧化应激水平明显增加，同时缝隙链接蛋白43的蛋白表达量上调。过表达PSMB10可以进一步加重上述现象。另外，IMD0354能够减少心房炎症和氧化应激，但不影响心房纤维化。综上所述，PSMB10在房颤发生中起到重要作用，IMD0453能够降低房颤、心房炎症和氧化应激，提示PSMB10可能是调节AngⅡ引发房颤的调节位点，抑制PSMB10可能成为治疗高血压相关的房颤的治疗靶点。

目录

声明

摘要

第一部分 免疫蛋白酶体亚基PSMB10基因敲除对房颤、心房纤维化、炎症、氧化应激的影响

前言

实验材料与实验方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 PSMB10基因过表达以及IKK抑制剂对房颤、心房纤维化、炎症、氧化应激的影响

前言

实验材料与实验方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 炎症、氧化应激与心房颤动

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