HDAC抑制剂Quisinostat对鼻咽癌CNE1细胞增殖抑制与诱导凋亡作用的研究

摘要

研究目的：　　研究表明EB(Epstein-Barr)病毒感染与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的发生发展有着密切的关系。潜伏膜蛋白1(LMP1)是EB病毒主要的转化基因产物，大多数EB病毒相关恶性肿瘤都伴有LMP1的异常表达，LMP1不仅能促进肿瘤的发病机理和疾病表型还能促进靶细胞增殖和颠覆细胞死亡程序，LMP1在鼻咽癌细胞中的表达具有一定的特异性，作为病毒-宿主相互作用的重要因素，LMP1可能是临床治疗鼻咽癌潜在的靶标。　　表观遗传过程与癌症进展密切相关。组蛋白的乙酰化状态调节转录因子进入DNA并影响基因表达水平。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)可以降低组蛋白的乙酰化水平，使DNA和组蛋白的结合更紧密，从而阻断基因转录。HDAC抑制剂能抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤的分化和凋亡，而对正常组织几乎没有影响。目前已有多种HDAC抑制剂被用于淋巴瘤的临床治疗，但在实体瘤鼻咽癌中却鲜有研究报道，我们将在体内外探究二代新型HDAC抑制剂Quisinostat(JNJ-26481585，JNJ)在鼻咽癌中的作用，为鼻咽癌的临床治疗提供新的选择。　　研究方法：　　1、通过RT-PCR实验研究EB病毒膜蛋白LMP1基因的表达量在临床鼻咽癌患者癌和癌旁组织中是否具有差异性。　　2、在鼻咽癌CNE1细胞系中稳定表达EB病毒的膜蛋白LMP1(CNE1-3G细胞为表达空载体的对照细胞，CNE1-3G-LMP1为过表达LMP1的稳定细胞株)。通过免疫印记实验检测LMP1在CNE1细胞中的表达效率。通过克隆形成实验以及Ki-67免疫荧光染色实验研究过表达LMP1对CNE1细胞增殖能力的影响。　　3、通过MTT实验研究CNE1-3G和CNE1-3G-LMP1细胞对HDAC抑制剂JNJ的敏感性。通过免疫印迹实验检测凋亡相关蛋白表达量的变化以及AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法研究HDAC抑制剂JNJ对CNE1-3G和CNE1-3G-LMP1细胞凋亡的影响。　　4、通过裸鼠皮下成瘤实验研究HDAC抑制剂JNJ能否在体内选择性作用于LMP1阳性的鼻咽癌细胞。将相同数量的CNE1-3G和CNE1-3G-LMP1细胞注射到裸鼠皮下(每组10只，雌雄各半)，当裸鼠出现皮下瘤时，每周3次腹腔注射HDAC抑制剂JNJ，并记录肿瘤的大小以及裸鼠的体重。　　研究结果：　　1、EB病毒的膜蛋白LMP1促进鼻咽癌CNE1细胞的增殖能力。CNE1-3G-LMP1细胞形成克隆的数量明显多于CNE1-3G细胞;CNE1-3G-LMP1细胞Ki-67免疫荧光染色的阳性率明显高于CNE1-3G细胞。　　2、HDAC抑制剂JNJ选择性作用于CNE1-3G-LMP1细胞，并显著性抑制CNE1-3G-LMP1细胞的增殖能力。　　HDAC抑制剂JNJ对LMP1阳性的CNE1-3G-LMP1和表达空载体的CNE1-3G细胞的半数抑制剂量(IC50)分别为0.4nM和23nM;CNE1-3G-LMP1细胞经过HDAC抑制剂JNJ处理后形成克隆的数目明显减少;免疫荧光染色实验显示CNE1-3G-LMP1细胞经过HDAC抑制剂JNJ处理后Ki-67染色的阳性率明显降低。　　3、EB病毒的膜蛋白LMP1促进鼻咽癌CNE1细胞的成瘤能力，HDAC抑制剂JNJ特异性的靶向LMP1阳性的鼻咽癌细胞。　　裸鼠皮下成瘤实验显示:①CNE1-3G-LMP1细胞的成瘤能力明显强于CNE1-3G细胞;②腹腔注射HDAC抑制剂JNJ组CNE1-3G-LMP1细胞所成皮下瘤的数量和大小明显小于注射PBS组CNE1-3G-LMP1细胞所成的皮下瘤;③腹腔注射HDAC抑制剂JNJ组CNE1-3G细胞所成皮下瘤的数量和大小与注射PBS组CNE1-3G细胞相比并无明显差别。　　研究结论：　　1、EB病毒的膜蛋白LMP1促进鼻咽癌细胞系CNE1的增殖及成瘤能力。　　2、HDAC抑制剂JNJ能特异性的抑制LMP1阳性鼻咽癌CNE1细胞增殖并诱导其凋亡。　　3、HDAC抑制剂JNJ在体内能特异性的靶向LMP1阳性鼻咽癌CNE1细胞，抑制LMP1阳性鼻咽癌CNE1细胞的成瘤能力。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．细胞培养

2 免疫印记(Western Blot)

3 平板克隆形成实验

4 反转录PCR

5 构建LMP1过表达细胞株

6 免疫荧光

7 流式细胞仪检测凋亡

8 MTT实验

9 病人标本RNA的提取

10 裸鼠皮下成瘤实验

11 统计学分析方法

结果

1 EB病毒的膜蛋白LMP1促进鼻咽癌CNE1细胞的增殖能力

2 HDAC抑制剂JNJ选择性抑制LMP1阳性鼻咽癌细胞的增殖能力

3 HDAC抑制剂JNJ选择性诱导LMP1阳性鼻咽癌细胞凋亡

4 EB病毒膜蛋白LMP1促进鼻咽癌CNE1细胞的成瘤能力，HDAC抑制剂JNJ在体内特异性的靶向LMP1阳性的鼻咽癌细胞

讨论

结论

参考文献

综述 HDAC抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展

致谢