不同尺寸纳米银、金粒子的免疫定量检测及银纳米粒子的免疫生物学效应

摘要

纳米材料的优良性质使得其被应用于生活生产的光、电、热、磁等各个领域中。在纷繁多样的纳米材料中，金属纳米材料，如纳米金和纳米银，引起了科学家们广泛的兴趣。其中纳米金可用来制备催化剂、传感器，纳米银则被广泛用来制作催化剂、抗菌剂、洗涤剂等。纳米产品的频繁使用带来了人们对其安全性的思考，调查研究显示纳米材料对生物体存在一定的毒理作用，例如纳米银，且毒理的大小与纳米粒子的尺寸大小有关。纳米材料在生命体安全性方面存在的问题使得人们对纳米材料的定量检测变得至关重要。
　　受文献的启发：首先制得不同尺寸纳米银，由于纳米银属于小分子，只具有免疫反应性而不具有免疫原性，因此，通过将其表面进行修饰，再连接上大分子蛋白质，得到了不同尺寸纳米银的全抗原。最后将不同尺寸纳米银全抗原注射到成年雄性新西兰大白兔体内，使之产生不同尺寸的纳米银抗体，最后利用酶联免疫分析法达到对待测尺寸纳米银的一种定量检测的目的。
　　通过免疫学与毒理学相结合的方法，将血清效价满足实验要求的雄兔动脉取血并将其内脏中各个器官（心脏，肝脏，肾脏，脾，生殖，大小肠）取出，用固定液固定，利用免疫组织化学的方法检测不同蛋白质在纳米银处理组和未经任何处理的空白对照组中的表达水平以及细胞形态、大小等方面发生的变化。具体工作内容如下：
　　1.化学还原法合成了50 nm Ag，20 nm Ag
　　利用柠檬酸钠还原法制得了50 nm Ag，20 nm Ag，其中20 nm Ag的合成是首先制备4nmAg的种子溶液，再通过种子溶液制得20 nm Ag溶胶。利用紫外可见分光光度计表征两种尺寸纳米银的最大吸收波长，扫描电镜表征两种尺寸纳米银的形状和大小。
　　2.化学修饰法制得了50 nm Ag免疫原，20 nm Ag免疫原
　　由于纳米银属于半抗原，虽然具有免疫反应性即能和抗体反应，但却无免疫原性即不能激发机体产生抗体，因此，需要将其连接上大分子蛋白质得到既有免疫反应性也有免疫原性的纳米银全抗原。具体方法为：利用Ag-S键，将巯基乙酸修饰到纳米银上，在修饰后的纳米银表面上用偶联剂1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）和碳二亚胺盐酸盐偶联上蛋白质，即得到了不同尺寸纳米银全抗原。
　　3.间接竞争酶联免疫分析法（ic-ELISA）定量检测50 nm Ag
　　将50 nm Ag半抗原制成全抗原，采取皮下多点注射的方法，注射到新西兰大白兔背部，使之产生抗50 nm Ag的多克隆抗体，再利用抗原抗体高效的结合，通过ic-ELISA法达到对50 nm Ag的定量检测。最终得到线性方程：A=0.720-0.065lgC，相关系数R2=0.98，最低检测限为0.0087ng/mL。加标回收率在84％-124.8%，从而得出结论：间接竞争酶联免疫分析法检测50 nm AgNPs，重现性高，操作简单，准确性好。
　　4.间接竞争酶联免疫分析法定量检测80 nm Au
　　继续利用间接竞争酶联免疫法定量检测了80 nm Au，通过建立标准曲线得到线性方程为：A=1.18-0.145lgC，相关系数R2=0.994，检出限为0.0057ng/mL，回收率为82%-117%。该方法灵敏度高，检出限低。
　　5.20 nm AgNPs，50 nm AgNPs的免疫生物学效应研究
　　利用免疫组织化学的方法研究了20 nm Ag，50 nm Ag两处理组以及空白对照组兔肝脏中谷草转氨酶（GOT2），乙酰胆碱酯酶（AChE），胆碱乙酰转移酶（ChAT），及兔睾丸中细胞核增殖抗原（PCNA）以及雄激素受体（AR）等蛋白的表达。结果发现，纳米银处理组中各蛋白的表达量与空白对照组有很大区别，且处理组的细胞形态，胆小管数目，发生了一定程度的病变。

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第一章 绪论

1.1纳米材料的性质及其应用

1.2纳米材料的研究现状

1.3纳米材料的表征

1.4免疫分析法

1.5课题研究设想

参考文献

第二章 两种尺寸纳米银抗原抗体的制备与表征

2.1引言

2.2试剂与仪器

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5小结

参考文献

第三章 间接竞争酶联免疫分析法定量检测50 nm银粒子

3.1 引言

3.2试剂与仪器

3.3实验方法

3.4 实验结果与讨论

3.5 小结

参考文献

第四章 间接竞争酶联免疫分析法定量检测80 nm金粒子

4.1 引言

4.2试剂与仪器

4.3实验方法

4.4 实验结果与讨论

4.5小结

参考文献

第五章 不同尺寸纳米银的免疫生物学效应研究

5.1 引言

5.2 试剂与仪器

5.3 免疫组化方法的过程

5.4 切片观察与结果讨论

5.5小结

参考文献

硕士期间发表的论文和获奖情况

致谢