乙醇脱氢酶ADH1B基因对人结直肠癌细胞增殖及遗传物质稳定性的影响

摘要

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球最常见的肿瘤，经济的发展、生活方式、饮食习惯的改变导致其发生率、死亡率明显上升并表现为年轻化，危害人类健康。CRC的发生不易察觉，当病人确诊时已是晚期，如何更早的发现及治疗成为研究的难题。ADH1B是乙醇脱氢酶家族的成员，研究发现ADH1B的表达量在结直肠癌与正常组织中存在着明显的差异。本实验将ADH1B基因过表达质粒转染SW620细胞，构建ADH1B基因过表达稳转细胞株，来探讨ADH1B基因过表达对SW620细胞增殖及遗传物质稳定性的影响。此外，采用奥沙利铂和阿司匹林单独及联合用药的方案，检测药物对细胞增殖的影响。旨在通过研究ADH1B基因与结直肠癌之间的相互关系，探讨基因手段与药物化疗联合治疗结直肠癌的方法，降低癌细胞多药耐药性，减轻患者痛苦，提高生存质量。
　　本研究主要内容包括：⑴通过脂质体转染获得过表达ADH1B基因的稳定细胞系，采用Western blot和Q-PCR技术分别从蛋白质水平、RNA水平检测ADH1B基因过表达效果；利用克隆形成实验、CCK-8法、细胞计数法来探究ADH1B基因过表达对SW620细胞增殖的影响。结果表明，过表达ADH1B基因显著促进SW620细胞的增殖(P＜0.05)。⑵通过微核试验来观察过表达ADH1B基因对SW620细胞遗传物质的影响。实验结果显示，与未过表达的SW620细胞相比，过表达组细胞的微核率、核芽率明显减少(P＜0.05)。推测ADH1B基因与结直肠癌细胞遗传物质的损伤存在一定的联系，过表达ADH1B基因可能会使得细胞通过某种方式清除微核，从而引起SW620细胞微核率降低，减少遗传物质损伤。⑶通过CCK-8法与台盼蓝染色来观察单独用药和两种药物不同贯序用药对SW620细胞的抑制作用，采用Annexin V-FITC&PI染色法区分细胞凋亡早、中、晚期以及坏死细胞，并利用半数抑制浓度(50％concentration of inhibition, IC50)确定药物的最佳使用浓度。结果显示，不同用药组对细胞抑制作用会伴随浓度的增加与时间的延长明显增强(P＜0.05)，通过分析发现四种用药组的抑制效果呈一定趋势：贯序组1＞贯序组2＞阿司匹林组＞奥沙利铂组，联合用药组中奥沙利铂/阿司匹林抑制效果大于阿司匹林/奥沙利铂，实验发现20μg/mL奥沙利铂/3.6mg/mL阿司匹林处理48h时细胞多处于早期凋亡，对结直肠癌细胞SW620损伤较小且抑制效果也很明显，是最适宜的联合用药浓度。

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英文缩略表

第一章 文献综述

1 肿瘤

2 乙醇脱氢酶与肿瘤

3 ADH1B

4 奥沙利铂与阿司匹林

5 微核试验(Micronucleus test, MNT)

6 实时荧光定量PCR

7 乙醇代谢通路

第二章 过表达ADH1B基因对人结直肠癌细胞SW620增殖的影响

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

第三章 过表达ADH1B基因对人结直肠癌细胞SW620遗传物质稳定性的影响

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

第四章 奥沙利铂联合阿司匹林对人结直肠癌细胞SW620增殖的影响

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

第五章 全文总结

参考文献

附录：主要仪器用品

致谢

附：本人读研期间获奖及论文发表情况