大乳头水螅α晶状体型热休克蛋白基因的克隆、抗血清制备及表达分析

摘要

α晶状体型热休克蛋白（alpha-crystallin-type heat shock protein,α-HSP）是脊椎动物眼睛晶状体中的一个结构蛋白，但在脊椎动物除了眼睛之外的其他组织器官中也表达α-HSP，其他许多生物体包括原核生物也表达该蛋白。α-HSP最重要的角色是作为细胞内重要的分子伴侣,与靶蛋白结合保证其正确折叠或是帮助细胞内应激损伤的蛋白质再次折叠，防止与之结合的这些蛋白质变性或失活。本课题组在进行大乳头水螅（Hydra magnipapillata）转录组数据分析时发现了头区再生进程中不同时段差异表达基因中有α-HSP基因EST（expressed sequence tag），为深入研究水螅α-HSP基因在其再生进程中的作用和角色，本研究开展了如下工作：
　　根据本实验室先期开展的大乳头水螅转录组实验获得的α-HSP基因的EST数据设计2条特异性引物，特异性引物分别与试剂盒接头引物配对进行5’RACE和3’RACE。再根据5’RACE和3’RACE PCR产物测序结果设计用于扩增大乳头水螅α-HSP基因编码区全长序列的上、下游特异性引物，以大乳头水螅SMART RACE cDNA文库为模板扩增了其α-HSP基因编码区全长序列。PCR产物纯化后与克隆载体pMD18-T连接，转化E. coli JM109菌株。运用菌落PCR方法鉴定阳性克隆后进行DNA测序(重组质粒命名为pMD18-T-α-HSP)，测序结果表明大乳头水螅α-HSP基因编码区全长序列为765个核苷酸，编码254个氨基酸。生物信息学分析表明大乳头水螅α-HSP内含2个类似于脊椎动物α晶状体蛋白的保守结构域。大乳头水螅α-HSP基因cDNA序列的成功克隆为深入研究水螅α-HSP蛋白的功能进化奠定了基础。
　　基于原核表达质粒pET-42a(+)多酶切位点的特点及大乳头水螅α-HSP基因序列特征设计引物，以已制备的pMD18-T-α-HSP重组质粒为模板经分子克隆方法把大乳头水螅α-HSP基因编码区全长序列连接到原核表达质粒pET-42a(+)上，构建重组原核表达载体pET-42a(+)-α-HSP，转化E. coli BL21（DE3）菌株，IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE胶检测结果表明本实验成功表达了大乳头水螅重组GST-α-HSP蛋白，并且该重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。大体积诱导表达的工程菌菌体经超声破碎获得上清液, 首先采用His-tag亲和层析柱从上清液中初步纯化重组蛋白，再经凝胶层析法(分子筛)进一步纯化后得到纯度较高的重组蛋白。以大乳头水螅重组GST-α-HSP蛋白为抗原，对BALB/C小鼠进行4次免疫，进一步采用ELISA方法测定小鼠抗血清效价约1:3280000。本实验获得的重组GST-α-HSP蛋白及其多克隆抗血清将有助于后续的关于水螅α-HSP蛋白的结构、表达动态及生理功能等科研工作的开展。
　　为深入研究水螅α-HSP基因在其头区再生进程中的作用，本研究采用实时定量荧光PCR和整体免疫组化方法对α-HSP基因在大乳头水螅头区再生进程的表达模式进行了探讨。结果显示，α-HSP蛋白主要在切割手术后伤口附近区域（再生部位）表达。无论是基于基因转录水平、还是基于蛋白质表达水平，再生进程的早期α-HSP基因表达上调，而在再生进程后期其表达下调。切割手术对生物体来说是具有冲击力的环境压力，在损伤后修复和再生初期热休克蛋白基因表达的上调可能具有重要的生物学意义。再生进程的早期由于伤口要愈合，伤口附近的干细胞启动分裂，此时α-HSP基因表达上调可能是干细胞启动分裂的一个关键诱导因子；而到了再生进程的后期，伤口已愈合，由干细胞分裂产生的新细胞逐渐分化成其他功能细胞，这时α-HSP基因表达下调。

目录

声明

第一章 α晶状体型热休克蛋白研究进展

1.引言

2.α晶状体型热休克蛋白的分布

3.α晶状体型热休克蛋白的寡聚化

4.α晶状体型热休克蛋白的结构

5.α晶状体型热休克蛋白在蛋白质折叠控制中的作用

6.α晶状体型热休克蛋白的其他生物学功能

7. 本研究的意义

参考文献

第二章 大乳头水螅α晶状体型热休克蛋白基因的克隆及生物信息学分析

1 引言

2 实验材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 大乳头水螅α晶状体型热休克蛋白基因的原核表达

1 引言

2 实验材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 重组大乳头水螅α晶状体型热休克蛋白的纯化及多克隆抗血清制备

1 引言

2 实验材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第五章 大乳头水螅头区再生进程中α晶状体型热休克蛋白的表达

1 引言

2 实验材料与方法

3 结果

4 讨论

参考文献

致谢