槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备

摘要

根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该AcPmp的编码区并连接到pMD19T simple中间载体.将测序正确的阳性菌提取质粒pMD1 9T-Ac Pmp,经Nco Ⅰ和XhoⅠ双酶切后回收AcPmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体pET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞.含有pET32a-AcPmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4h,可产生部分可溶性的融合蛋白.利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白.将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000.Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合.