抗血清制备

摘要： 本课题组前期基于酵母单杂交技术筛选出响应2-十三烷酮诱导CYP6B6过表达的6个调控因子,乙醇脱氢酶5(HaADH5)是其中之一,乙醇脱氢酶是一种代谢乙醇的重要酶类,在哺乳动物中的研究很多,但在昆虫中的研究很少.为了进一步探究HaADH5是否参与P450 CYP6B6的过表达,进而参与棉铃虫对包括杀虫剂在内的外界有毒物质的代谢.本实验将pET32a-HaADH5转化至大肠杆菌Transetta中进行诱导表达,Western blot进一步验证融合蛋白His-HaADH5的表达,通过镍柱纯化获得融合蛋白His-HaADH5,且测定了酶活.用蛋白免疫法制备了鼠抗His-HaADH5的血清,Western blot分析了该抗血清的免疫特异性,继而用此抗体检测了HaADH5在不同组织中的表达.活性分析表明,在NAD+的存在下,融合蛋白可以对不同醇类和甲醛进行脱氢,尤其对异戊醇的脱氢活性最高,活性为1333 U/mg.制备的抗血清效价为1:409600.Western blot结果表明,该抗血清既能与融合蛋白His-HaADH5结合,也能与棉铃虫体内的HaADH5结合,还发现HaADH5在脂肪体中的表达量最高.原核表达的融合蛋白能代谢异戊醇,制备的抗血清具有较好的免疫特性,这些结果为HaADH5蛋白水平的鉴定以及功能研究提供了重要的检测工具,也有助于我们更好地探索棉铃虫乙醇脱氢酶5的功能.

摘要： [背景和目的]植物未折叠蛋白应答(Unfolded protein response,UPR)信号通路在植物生长发育调控、逆境胁迫应答、内质网压力缓解等过程中起到重要作用,其中的bZIP60蛋白在该通路中起到关键核心作用.为了检测本氏烟UPR机制中bZIP60蛋白的表达,制备其抗血清用以探究其生物学功能.[方法]通过RT-PCR方法从本氏烟中克隆了bZIP60基因,然后将该基因连接至原核表达载体pET28a上,导入大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中,经1 mM IPTG诱导表达分子量约35 kDa的融合蛋白,用Ni-NTA亲和柱纯化获得靶标蛋白.最后以纯化的bZIP60蛋白辅以佐剂皮下免疫新西兰大白兔制备抗血清.[结果]Western blot分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测到由喷施DTT引起本氏烟中bZIP60蛋白的表达.[结论]本研究通过原核表达技术成功获得融合His标签的bZIP60重组蛋白并制备了相应的抗血清,为下一步深入探究病原物与植物互作中bZIP60的分子机理提供研究基础.

摘要： 【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是柑橘产业的头号杀手,其病原主要是韧皮部杆菌属亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas),为革兰氏阴性菌,田间主要经亚洲柑橘木虱(Diaphorina citri)传播,为深入研究该病菌分泌蛋白的功能,笔者筛选其中1个分泌蛋白,进行原核表达并制备抗体。【方法】设定4点条件从Prasad等预测的166个分泌蛋白基因中筛选,与pET-28a构建重组表达载体,以原核表达的融合蛋白作为抗原,用于注射兔子,制备多克隆抗体。【结果】从预测的166个分泌蛋白基因中筛选出05150基因,成功构建表达载体pET-28a-05150,表达菌株pET-28a-05150在18°C、0.1 mmol·L^-1 IPTG浓度条件下诱导的目的蛋白为包涵体。获得的pET-28a-05150抗血清通过ELISA效价为1∶4000,通过dot ELISA检测手段可与田间感病样品发生显色反应,通过Western blot能与融合蛋白杂交出特异性条带。【结论】该研究筛选了CLas的分泌蛋白基因05150,以其体外表达蛋白制备了pET-28a-05150抗血清,为研究05150基因功能奠定前期基础,也为建立HLB的血清学检测手段及探究柑橘黄龙病菌分泌蛋白基因的筛选方法提供参考。

摘要： 以鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus,SVCV)shlj1分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增获得SVCV糖蛋白(Glycoprotein,G)部分基因序列(420 bp),克隆至pET-32a原核表达载体,构建重组质粒pET-32a-G;将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta表达菌株,利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对截短G蛋白的表达及纯化情况进行检测;将纯化的G蛋白免疫小鼠制备鼠抗血清,采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和细胞间接免疫荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody test,IFAT)对抗血清进行鉴定.SDS-PAGE结果显示该重组截短G蛋白与预期大小相符(约为35 kDa),以包涵体的形式表达;ELISA结果显示,制备的鼠抗截短G蛋白血清效价为1:80000;IFAT结果显示,抗血清能够识别不同地区的SVCV分离株(黑龙江省3株,辽宁省2株),在FITC标记的羊抗鼠IgG作用下,呈特异性绿色荧光.结果表明,制备的截短SVCV G蛋白具有良好的免疫原性,利用其所制备的抗体能够识别我国不同SVCV分离株病毒表面天然结构的糖蛋白.

摘要： 【目的】研究猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,AcVA)的发生及其多样性,为我国猕猴桃产业中AcVA病毒的快速检测、科学防控以及猕猴桃品种选育提供科学依据。【方法】通过巢式PCR从四川省猕猴桃感病叶片中扩增AcVA CP基因序列,进行序列分析和同源性比对;构建AcVA CP基因的原核表达载体,诱导目的蛋白表达后制备抗血清,用Western blot检测效价。【结果】克隆到3个AcVA四川分离株的完整CP基因序列,成功构建了pET28a-AcVA-DJY4-CP重组质粒,原核表达目的蛋白并制备出特异性抗血清,效价达到1∶5 000。【结论】首次获得了3个AcVA四川分离株,丰富了AcVA的序列多样性,并探索了原核表达的最佳条件,制备了高效价抗血清,为今后AcVA病毒的快速检测和防控提供了技术支撑。

摘要： 采用RT-PCR方法扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,将其连接到原核表达载体pEHISTEV上,获得重组质粒pEHISTEV-PVY-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达出分子量为35 kD的融合蛋白.切胶回收融合蛋白,免疫新西兰大耳兔制备PVY CP抗血清.间接ELISA结果表明,该抗血清的效价为1∶16384,Western blot分析表明该抗血清只与感染PVY的普通烟植株有特异性反应,而与健康普通烟和感染PVX的普通烟植株无反应.本研究为PVY的血清学检测以及早期预警奠定了基础.%The coat protein (CP) gene of Potato virus Y (PVY) was amplified by RT-PCR and was cloned into prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PVY-CP,which was transformed into competent cells of Escherichia coli strain Rosetta,and a 35 kD fusion protein was expressed after induced by IPTG.The fusion protein was cut from the gel and used as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against the PVY CP.The titer of the resultant antiserum was 1∶16384 in ELISA.In Western blot assay,the antiserum showed specific positive reaction only with Nicotiana tabacum plants infected with PVY,but not with healthy Nicotiana tabacum plants or those infected with Potato virus X.The results laid bases for serological test and early warning work of PVY.

摘要： 柑桔黄龙病菌菌毛形成蛋白(pilus formation protein,408)是一种丰度较高的分泌蛋白.以感染柑桔黄龙病(HLB)的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,利用408基因的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段.序列分析结果表明海南琼海黄龙病菌408基因与柑桔黄龙病菌亚洲种psy62株系(GenBank登录号:CP001677.5)408基因序列一致.功能预测结果表明其含有一个与菌毛形成相关的N端结构域,以及C端含有两个高度保守的基序(Motif 1和Motif 2).通过EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切构建重组载体pET32a-408并将其转化BL21(DE3)大肠杆菌.重组菌经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达.目的蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化,并以此为抗原,腹腔免疫小白鼠,获得效价在1:500～1:10000的多克隆抗血清;Western blot进一步分析表明,408蛋白多克隆抗血清特异性强.研究结果为柑桔黄龙病菌408蛋白功能研究和柑桔黄龙病菌的蛋白检测产品开发提供重要科学依据.

摘要： 以感染番木瓜环斑病毒西瓜株系(papaya ringspot virus-watermelon strain,PRSV-W)的西葫芦叶片为供试材料,通过RT-PCR克隆PRSV-W衣壳蛋白(coat protein,CP)基因,并将其连接到原核表达载体pEHISTEV上得到重组质粒pEHISTEV-PRSV-W-CP.将其转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后可表达分子量约为37 kD的融合蛋白.将融合蛋白从凝胶中切下,乳化后免疫新西兰长耳兔,制备PRSV-W CP的抗血清.间接ELISA测定该血清效价为1∶8192.Western blot检测结果表明,该抗血清只与感染PRSV的西葫芦样品有特异性反应,而与健康西葫芦、感染西瓜花叶病毒的西葫芦及感染马铃薯Y病毒的普通烟样品均无反应.本研究为PRSV的快速检测以及CP蛋白功能的研究奠定了基础.%The coat protein (CP) gene of papaya ringspot virus-watermelon strain (PRSV-W) was amplified by RT-PCR from infected zucchini leaf samples and cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-PRSV-W-CP.The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain Rosetta and expressed a fusion protein with molecular weight of 37 kD after induction with IPTG.The fusion protein was cut from the gel,emulsified and used to immunize the New Zealand rabbits to produce polyclonal antiserum against the CP of PRSV-W.The titer of the resultant antiserum was 1∶8192 in ELISA.In Western blot analysis,the antiserum showed specific positive reaction only with the zucchini plants infected with PRSV,but not with healthy zucchini plants or those infected with Watermelonmosaic virus,or Nicotiana tabacum plants infected with Potato virus Y.This research laid foundations for the detection of PRSV and functional studies of PRSV CP.

摘要： 为了建立百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的快速检测方法,采用RT-PCR方法从感染LMoV的百合叶片中克隆该病毒的外壳蛋白(coat protein,Cp)基因,然后连接到原核表达载体pET28a(+)上,导入大肠杆菌Escherichia eoli BL21 (DE3)并诱导表达,以表达的重组蛋白为抗原制备该病毒的抗血清.结果显示:LMoV CP全长为822 bp,编码274个氨基酸;SDS-PAGE及Westernblot检测结果表明,经IPTG诱导得到了分子量约为34 kD带有HIS标签的目的蛋白;用该蛋白制备的抗血清经间接ELISA和Western blot检测结果显示,其效价为1:51 200,具有较高的特异性,可用于感染LMoV百合的检测,其检测结果与RT-PCR检测结果一致.%In order to establish a rapid method of detecting Lily mottle virus (LMoV),the coat protein (CP) gene of LMoV cloned from the virus-infected lily with RT-PCR method,then constructed into the prokaryotic expression vector pET28a(+),and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3).The recombinant protein obtained from the induced-expression was used as an antigen to prepare antiserum for the virus.The sequence analysis showed that the complete nucleotide sequence of LMoV CP was 822 bp,and encoded 274 amino acids.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that a 34 kD target protein with HIS tag was obtained from prokaryotic expression induced by IPTG.Indirect ELISA,and western blot detection of the titer of the antiserum was 1:512 000 with high specificity to LMoV.The target protein could be used for LMoV detection in lily,and its detection result was consistent with RT-PCR.

摘要： 高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大.本研究根据SrMV外壳蛋白(coatprotein,CP)基因序列合成一对引物,以海南(SrMV-HN)染病植株总RNA为材料,采用RT-PCR方法克隆了长约987bp的目的片段.将CP基因与质粒pET32a(+)连接,构建了含SrMV CP基因的融合蛋白原核表达载体pET32a-SrMVCP.然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测出一条约36kD的特异融合蛋白表达谱带.融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达.通过优化诱导条件,确立了CP基因表达的最佳条件:IPTG终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为30°C.用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清.通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的SrMV CP抗血清工作浓度为1:1000,Western blotting检测结果表明,抗血清与SrMV-HN诱导表达的CP蛋白发生特异性反应.对田间25个甘蔗样品进行检测,结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测.

摘要： 本研究应用生物信息学分析工具对大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白H抗原(flic基因)抗原表位进行分析,筛选出抗原表位较富集的胞外区片段;优化基因序列,使其适合在原核载体中表达.构建重组质粒pgex4t-2-flic和pet28a(+)-flic,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,GST胶亲和层析技术和金属螯合层析技术纯化GST标签和His标签的目的蛋白,获得了高纯度的GST-flic和His-flic.使用His-flic抗原免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测体液免疫效价,兔颈动脉取血并离心制备获得大量兔抗血清.两种标签目的蛋白的纯化和兔血清多抗的制备为大肠杆菌O157:H7的检测提供了实验依据和物质基础.

摘要： 植物病毒侵染寄主的过程非常复杂，而主要导致寄主致病的能力取决于病毒蛋白与寄主因子之间的相互作用。已有许多研究发现植物寄主因子能与植物病毒基因编码产物（包括外壳蛋白、运动蛋白、复制相关蛋白）相互作用。利用酵母双杂交系统筛选到1个与番茄花叶病毒(ToMV)外壳蛋白(CP)相互作用的烟草蛋白，并命名为IP-L。进一步利用酵母双杂交和GST-Pulldown实验对IP-L和ToMV CP上二者相互作用位点进行了研究，结果发现IP-L N端的α-螺旋区域（1～20位氨基酸）和ToMV CP中的2个α-螺旋区域(16～31位氨基酸、138～149位氨基酸)为二者的相互作用所必需。目前对IP-L与病毒的蛋白的相互作用主要集中在对二者相互作用位点以及在细胞中的定位的研究，而对病毒侵染寄主后，寄主蛋白在植物体内的表达情况知之甚少。本实验根据GenBank上已报道的IP-L全长序列设计特异性引物，从实验室自己种植的普通烟中扩增得到长度465bp的片段，与预期的结果相符。将目的片段与质粒pEGX-6p-l连接，构建了包含基因的原核表达载体pEGX-IP-L，并导入大肠杆菌BL21中。在37°C培养、1.0mmol/LIPTG诱导条件下表达出融合蛋白GST IP-L，SDS-PAGE电泳检测分析表明成功表达出分子质量约为42kDa的目的融合蛋白GST-IP-L。以表达的融合蛋白为抗原，免疫家兔，制备的抗血清的效价为1/6400。用获得抗体进行westemblot分析表明该血清具有良好的特异性，可用于检测病毒侵染寄主后，寄主蛋白在植物体内的表达情况。

摘要： 目的：本研究原核表达了猪源的Mx1蛋白，目的制备高免抗血清，为今后鉴定猪源Mx1抗猪瘟病毒的机理奠定基础。方法：根据GenBank所收录的猪源Mx1基因序列，设计了一对特异性引物，以pT-poMx1为模板，PCR亚克隆出poMx1基因，构建原核表达载体pGEX-poMx1。经酶切鉴定和序列测定后，重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)。结果：Western blot结果显示包涵体蛋白切胶免疫产生的鼠抗血清与GST蛋白孵育过，其血清只能与重组蛋白poMx1在99Ku处产生特异性条带。说明制备的鼠源多抗可以有效地检测poMx1蛋白。结论：本实验有效制备了鼠抗Mx1血清，为后续使用该抗体追踪鉴定poMx1在细胞内抑制猪瘟病毒的复制机理提供物质基础。

摘要： 本文人工合成了CRLV cp基因，并将其克隆到了原核表达载体pGEX-4T-3载体上，连有CRLV cp的重组载体经过测序验证后，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导CRLV cp基因表达。利用MagneGST蛋白回收试剂盒(Promega)回收融合蛋白，然后用所回收的融合蛋白免疫兔子，制备了CRLV的特异性抗血清。Western Blot验证结果表明，所制备的CRLV cp抗血清能够特异性的检测GST-CRLV CP融合蛋白以及病叶中的CRLV CP，而与健康叶片的非特异性反应背景较低。

摘要： 本发明提供一种抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清的制备方法及由其制备的多克隆抗血清与应用。其中，所述方法包含采用SEQ ID NO:1所示序列表示的抗原通过动物免疫获得所述抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清。所述抗原通过下述步骤制得：1)家蚕BmGATA6的克隆和分析：2)家蚕BmGATA6的原核表达及蛋白纯化。本抗血清可以用于家蚕BmGATA6蛋白及与其高度保守的鳞翅目GATA蛋白功能的基础研究，包括western及免疫荧光等方面的检测。

摘要： 本发明公开了一种抗苹果坏死花叶病毒的抗血清及其制备方法。本发明所提供的制备抗苹果坏死花叶病毒的抗血清的方法包括如下步骤：以苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白作为免疫原免疫动物。本发明利用分子生物学手段通过在大肠杆菌中高效表达苹果坏死花叶病毒的外壳蛋白基因，纯化出目的蛋白，以其免疫新西兰兔，制备得到了专一型的多克隆抗血清，本发明为该病毒的血清学检测以及苹果生产中该病害的防控提供理论基础。

摘要： 本发明涉及抗原结合片段(Fab)和包括该抗原结合片段(Fab)的Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽。本发明的Fab特异性结合血清白蛋白，从而具有延长的体内半衰期。本发明的Fab的特征在于，没有对CH1结构域和CκL结构域中的链间二硫键负责的半胱氨酸残基。本发明的Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽可在大肠杆菌E.coli的细胞周质中进行高产量生产，并且具有增加的体内半衰期。另外，本发明提供了一种产生多种Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽的大肠杆菌E.coli菌株，和一种包括所述Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽的药物组合物。

摘要： 本发明涉及一种从热泉宏基因组中分析得到的抗血清干扰Taq DNA聚合酶，并涉及这种抗血清干扰的Taq DNA聚合酶及其制备方法和应用。本发明的抗血清干扰的Taq DNA聚合酶，其蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；编码这种抗血清干扰的Taq DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。该酶的蛋白质氨基酸序列与野生Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，有13个氨基酸的突变。将该序列构建克隆并进行聚合酶的表达和纯化，该酶具有比商业化的Taq DNA聚合酶和野生型的Taq DNA聚合酶更高的聚合酶活性，将该酶用于血清中模拟样本检测，荧光定量PCR结果表明该酶比野生型Taq DNA聚合酶及商品化的聚合酶有更好的耐受性。因此该酶可用于免核酸提取的血清样本进行直接PCR检测。

摘要： 本发明提供一种抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清的制备方法及由其制备的多克隆抗血清与应用。其中，所述方法包含采用SEQ ID NO:1所示序列表示的抗原通过动物免疫获得所述抗家蚕BmGATA6多克隆抗血清。所述抗原通过下述步骤制得：1)家蚕BmGATA6的克隆和分析：2)家蚕BmGATA6的原核表达及蛋白纯化。本抗血清可以用于家蚕BmGATA6蛋白及与其高度保守的鳞翅目GATA蛋白功能的基础研究，包括western及免疫荧光等方面的检测。

摘要： 本申请公开了一种制备高特异性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法，该方法包括采用Seq ID No.1所示序列的抗原通过动物免疫制备获得抗Lp（a）多克隆抗血清。本申请的制备高特异性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法克服了传统方法的血浆来源困难、社会供给不足的问题；并且，所制备的抗Lp（a）多克隆抗血清效价高，特异性强，不会与LDL或PLG发生交叉反应，从而提高了Lp(a)检测的准确性和有效性，为Lp(a)检测的推广应用奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种黄鳝生长催乳素抗血清及其制备方法与应用，该抗血清通过构建含有SEQ ID NO:4所示核酸分子的表达质粒，转染细菌获得重组菌，使用异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达，分离纯化得到黄鳝Sml抗原，然后将黄鳝Sml抗原常规免疫试验动物，三次免疫后收集血清，即得黄鳝生长催乳素抗血清。该方法操作简单、制备高效，制备的得到的抗血清效价高，可达到可达1：4096000以上，而且特异性强，不会受到其他垂体激素的干扰。

摘要： 本发明公开了一种鲤TLR4鼠抗血清的制备方法及应用，黄河鲤TLR4鼠抗血清的制备方法包括鲤TLR4基因开放阅读框的克隆；鲤TLR4基因重组表达载体pET‑32a(+)‑TLR4的构建；鲤TLR4重组蛋白的诱导表达、纯化及Western Blot的特异性分析；鲤TLR4鼠抗血清的制备。本发明采用分子生物学和基因工程的方法构建了鲤TLR4基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。本发明制备的鲤TLR4鼠抗血清可用于（荧光）免疫组化、蛋白印迹和酶联免疫吸附等实验要求，建立体外免疫分析、研究鲤TLR4的功能以及鲤免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于其他鲤科鱼类TLR4的免疫检测。

摘要： 本发明公开了β2‑微球蛋白多抗血清的制备方法，包括：利用β2‑微球蛋白抗原免疫实验兔不多于4次，每次免疫至少选取12个皮下注射点。本发明减少了免疫次数和免疫抗原的用量，省了时间成本和原料与人力成本。

摘要： 本发明公开了一种利用兔生产抗人ApoA1多抗血清的方法，选用体格强健、免疫力好的10月龄雄性日本大耳兔为免疫动物，行肩前皮下+腹股沟皮下+颈背部皮下低剂量多点免疫，依据免疫期动物血清抗体滴度优化免疫剂量及免疫间隔，旨在激活多部位淋巴细胞提升免疫效价及获得稳定抗体水平，保障抗体原料性能稳定。