牛干扰素诱导蛋白10的原核表达及其单克隆抗体的研制

摘要

干扰素诱导蛋白10(interferon-inducible protein-10，IP-10)是抗原提呈细胞经细胞因子刺激后分泌的趋化因子，属于CXC趋化因子家族。IP-10在感染性疾病、自身免疫性疾病、同种异体移植排斥反应、肿瘤、慢性炎症等疾病中可选择性地募集T淋巴细胞、自然杀伤细胞和单核细胞到损伤部位，发挥重要的宿主免疫防护作用。最近的研究显示IP-10表达水平的改变与感染性疾病，包括炎症性疾病、免疫功能异常与肿瘤的发展等相关。IP-10也开始在牛结核等感染性疾病的诊断中作为重要的生物标志物，其效果也常与γ-干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)相比较。有研究表明联合检测IFN-γ和IP-10能提高牛结核诊断的敏感性。本研究克隆表达了牛IP-10基因并制备了牛IP-10单克隆抗体，为牛结核的预防与诊断研究提供了重要的生物材料。　　1.牛IP-10基因的克隆及原核表达　　用ConA刺激健康奶牛外周血淋巴细胞，并提取细胞总RNA，以RT-PCR方法反转录为cDNA，再以cDNA为模板成功扩增到所需目的基因。将目的基因分别与表达载体pGEX-6p-1和pET-30a(+)相连接构建重组质粒，并进行鉴定。鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)，分别构建了BL21(DE3)-pGEX-6p-1-BoIP-10口BL21(DE3)-pET-30a-BoIP-10。经IPTG诱导表达后的SDS-PAGE分析，出现预期的目的条带，条带大小分别为36 kDa和16 kDa左右。通过GST和His免疫亲和层析法进行蛋白的纯化，Westernblot结果显示纯化蛋白具有良好的免疫反应性，说明2种标签的重组蛋白rGST-BoIP-10和rHis-BoIP-10均获得成功表达。　　2.牛IP-10单克隆抗体的制备与鉴定　　将纯化重组蛋白rHis-BoIP-10免疫6周龄BALB/c小鼠，经3次免疫后，运用淋巴细胞杂交瘤技术融合细胞，以纯化重组蛋白rGST-BoIP-10为检测原，运用间接ELISA方法筛选阳性克隆，经过2次亚克隆后，共获得8株能稳定分泌特异性BoIP-10单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为3E11、2A5、1C6、3B12、3E12、2D5、2H8、3A12。亚型鉴定结果显示2A5和3E12单抗为IgM亚型，3E11和2D5为IgG2a亚型，2H8的为IgG3亚型，1C6、3B12、3A12为IgG1亚型。间接ELISA测定效价结果显示3E11、2A5、3B12、3E12、2H8五株单抗上清效价均不超过6400，其余3株1C6、2D5、3A12上清效价比较高，在1.0×104以上;制备上述单抗腹水，间接ELISA测定其效价，除了2A5的腹水效价比较低，其余7株单抗的腹水效价均在1.0×106以上。间接ELISA还显示3E11、2A5、2D5、2H8四株单抗与大肠杆菌表达的商品化牛IP-10有较好的反应性，2A5、2D5、2H8等3株单抗与毕赤酵母表达的商品化牛IP-10有较好的反应性。Western blot结果显示所获得的8株单抗均与融合蛋白rHis-BoIP-10和rGST-BoIP-10发生反应。应用流式细胞术胞内染色技术分析单抗与天然IP-10蛋白的反应性，结果显示3E11，2D5和3A12与天然BoIP-10有较好的反应性。阻断ELISA结果也表明2D5与天然BoIP-10有较好的反应性。这些结果表明2D5单抗与天然牛IP-10反应性良好，具有较好的应用潜能。

目录

摘要

符号说明

文献综述 IP-10的生物学特性及其在感染性疾病中的诊断价值

1 IP-10生物学特性

2 IP-10与疾病的关系

3 IP-10对于感染，I生疾病的诊断价值

参考文献

第一章 牛IP-10基因的克隆及原核表达

1．材料与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 牛IP-10单克隆抗体的制备与鉴定

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

致谢

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