牛IFN-γ基因的原核表达及单克隆抗体的研制

摘要

本研究参考GenBank中牛IFN-γ的cDNA基因序列，设计合成了一对含酶切位点的引物，PCR扩增出不含信号肽的IFN-γ基因，克隆进pMD18-T Simple Vector，将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中，转化BL21(DE3)宿主菌，构建出重组表达质粒pET-IFN-γ，经PCR和BamHI、HindIII酶切鉴定表明构建正确。IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量37ku左右处出现新的蛋白条带。乳化后免疫兔子获得抗IFN-γ特异性免疫血清，抗牛IFN-γ血清抗体效价分别为：1:1×105。利用IPTG诱导大肠杆菌表达牛-γ干扰素融合蛋白，免疫BALB／c小鼠。利用杂交瘤技术制备并筛选出1株分泌特异性抗牛BoIFN-γ的杂交瘤细胞株，命名为E11-2F10。采用ELISA方法筛选、Western-blotting方法进行鉴定，该单抗可以与重组His-BoIFN-γ反应，但与His-Cfp10融合蛋白不反应，说明单抗具有良好的特异性。