TALENs介导的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究

摘要

TALENs技术是最近几年来迅速发展起来的基因靶向修饰技术，该技术能够简单、高效的在目标靶基因位点处产生多种突变效应，现已被广泛应用于各种动植物细胞及个体的基因修饰研究中。与经典的基因打靶技术相比，TALEN核酸酶在与基因打靶载体的共同作用下，具有“一步法”完成目标基因的敲除和外源基因定点敲入的优势。本研究通过利用TALENs基因编辑技术和hLF基因打靶载体在山羊BLG基因第一外显子起始密码子附近敲除目标靶序列，并在敲除位点引入人乳铁蛋白基因，从而降低山羊乳汁中对人具有致敏作用的β-乳球蛋白的含量，提高羊奶的营养和消费价值。　　本研究的目的是应用TALENs技术与山羊β-乳球蛋白调控序列，PCR扩增获得的hLF cDNA基因序列，人巨细胞病毒启动/增强子(Pcmv)和SV40 poly A以及HSV-TK的负筛选基因等元件，构建含新霉素抗性筛选基因(Neo)的乳腺特异性表达hLF的基因打靶载体。用构建获得的TALENs和乳腺特异性打靶载体转染山羊胎儿成纤维细胞，筛选获得转基因单克隆细胞株，并通过体细胞核移植技术制备在BLG基因上定点敲入hLF的转基因山羊。移植受体并通过怀孕出生的转基因山羊，用来培育新一代高产优质不含对人致敏的，并富含对人体有益的人乳铁蛋白转基因乳用奶山羊新品系。　　山羊β-乳球蛋白基因(BLG)位于11号染色体，全长8088bp，编码BLG的转录单元长4698bp，5'端非翻译区2148bp，3'端非翻译区1242bp，含有七个外显子，六个内含子。本研究设计实验，按照已有报道的TALENs设计原则，以山羊BLG基因序列为模板设计TALENs，在第一外显子ATG-2189起始密码子附近选取2条靶序列，作为指导构建TALENs表达载体的靶向识别序列。选取与靶序列相对应的识别双残基模块和骨架载体，经过连接、转化、筛选、鉴定，最终获得2对TALEN表达载体(TALEN-L12/TALEN-R12、TALEN-L18/TALEN-R18)，TALENs表达载体的构建为TALENs活性鉴定及BLG基因定点修饰的研究奠定基础。　　为了获得能够在山羊乳腺中特异性高效表达人乳铁蛋白的载体，本研究以山羊BLG基因为模板，PCR分别扩增出山羊5'调控序列1035 bp和3'调控序列1826bp，再以本实验室保存的BLC14为基础，载体包括5'调控序列、CMV启动/增强子、hLF cDNA基因序列、SV40polyA启动/增强子、Neo基因和3'调控序列，并通过PCR扩增的方法获得其功能基因序列，然后连接上述BLG调控序列，鉴定插入序列的正反向，挑取正确的载体。在确定正确的乳腺特异性基因表达载体之后，通过酶切线性化，再与实验室保存的含有一个HSV-TK的负筛选基因序列相连接，从而获得本实验需要的乳腺特异性表达hLF的基因打靶载体，并命名为BLTF-7-82。　　基因打靶载体BLTF-7-82与TALEN-18L/18R质粒共转染30日龄原代山羊胎儿成纤维细胞，细胞转染三天后通过药物对进行筛选。所用药物浓度为G418(800μg/mL)和GCV(10μg/mL)，正负筛选维持7-14天，挑取细胞6孔板上生长状况良好的细胞克隆株，传代到24孔板中继续培养，此时药物正负筛选的浓度降低一半，最终获得药物抗性胎儿成纤维细胞125株。将筛选获得的阳性细胞进行消化，并应用特异性引物进行整合情况的检测。首先用引物cmv-1/cmv-2对人乳铁蛋白和CMV基因进行整合检测，PCR产物大小为775bp，能扩增出目的条带的样品则为整合hLF的阳性细胞株，获得整合细胞株89株。之后将整合hLF的阳性细胞株的单克隆细胞株基因组，再分别用引物5farcmv-1/5far cmv-2和neo3far-1eo3far-2对其进行定点整合检测，PCR产物大小分别为1703 bp和3604bp，同时扩增出上述两个条带，才能确定为在BLG基因上定点整合人乳铁蛋白外源基因的阳性细胞株，根据PCR检测与序列比对结果最终确定1株细胞为定点整合hLF外源基因的阳性细胞株，其基因打靶效率约为1.5×10-6。　　同源重组检测显示该细胞株为在山羊BLG基因座上双等位定点整合人乳铁蛋白外源基因的阳性细胞株，把该单克隆阳性细胞株命名为LDK-16进行后续的体细胞核移植。以单克隆阳性细胞株LDK-16作为供核细胞进行体细胞核移植，制作重构胚胎151枚，重构胚移植受体山羊10只，胚胎移植后30天B超检测到妊娠受体7只（妊娠率70％）。

目录

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．动物基因打靶的研究进展

1．1 动物基因打靶的简介

1．2 动物基因打靶技术的应用和前景

1．3 基因打靶的新技术

1．4 动物基因打靶中存在的障碍和优化措施

2．TALENs基因定点修饰技术研究进展

2．1 TALENs基因修饰技术简介

2．2 TALENs的基本结构与技术原理

2．3 TALENs的设计与构建

2．4 TALENs的应用和展望

3．人乳铁蛋白的研究进展

3．1 人乳铁蛋白的简介

3．2 人乳铁蛋白的主要生理作用

3．3 转基因动物乳腺特异性表达重组hLF的研究进展

第二章 山羊BLG基因TALENs的设计与构建

1．实验材料

1．1 主要试剂

1．2 试验仪器及器材

1．3 主要试剂的配制

2．实验方法

2．1 BLG基因的检索

2．2 TALENs的设计

2．3 TALENs表达载体的构建与鉴定

3．结果

第三章 乳腺特异性表达hkF基因打靶载体的构建

1．试验材料

1．1 菌种及质粒

1．2 试验仪器

1．3 分子生物学试剂

1．4 主要试剂的配制

2．实验方法

2．1 PCR引物合成和测序

2．2 常规分子生物学的操作方法

2．3 质粒酶切反应

2．4 酶切产物的回收

2．5 连接反应

3．乳腺特异性打靶载体的构建

3．1 PCR扩增BLG5’、BLG3’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区

3．2 山羊BLG5’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区相连

3．3 山羊BLG3’调控序列和表达载体BF相连

3．4 含单个负筛选HSV-TK基因与乳腺特异性表达载体BFN-7相连

4．结果

4．1 山羊BLG5’和BLG3’调控序列的扩增

4．2 PCR扩增乳腺特异性表达载体功能区

4．3 乳腺特异性表达hLF基因打靶载体的构建

第四章 基因打靶细胞系和基因打靶山羊的制备

1．试验材料

1．1 试验仪器

1．2 试验器械

1．3 主要试剂

1．4 试验动物

2．试验方法

2．1 胎儿成纤维细胞的准备

2．2 打靶载体与TALENs转染胎儿成纤维细胞

2．3 细胞株PCR检测

2．4 体细胞核移植制作基因打靶山羊胎儿

3．结果

3．1 抗性细胞株的整合检测

3．2 转染基因打靶载体细胞统计结果

4．讨论

第五章 全文总结

参考文献

致谢

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