miR-1826在大肠癌中的表达和临床意义及其对SW480细胞生物学行为影响的实验研究

摘要

目的:检测miR-1826在大肠癌患者中的表达情况并分析其在对临床相关性。同时,通过miRNA inhibitor转染干扰大肠癌SW480细胞中miR-1826的表达,观察其对大肠癌细胞增殖、周期、凋亡及侵袭迁移的影响,探讨miR-1826在大肠癌中的生物学作用,进一步分析其潜在靶基因,为大肠癌的靶向基因治疗奠定基础。　　方法:1、收集大肠癌患者标本72例,同时收取癌组织及相应的癌旁组织。通过SYBR GREEN荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组织中miR-1826的表达水平。培养五株大肠癌细胞株,采用qRT-PCR方法筛选出miR-1826高表达细胞株SW480,备后续实验使用。2、通过生存分析探究miR-1826在大肠癌中表达跟患者预后的关系,并分析miR-1826表达水平跟临床病理参数的相关性,在通过单因素及COX多因素分析讨论miR-1826在大肠癌中预后影响的独立性。3、以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体将带荧光标记的miRNA inhibitor转染SW480细胞并用流式细胞仪检测从而筛选出最佳转染条件。设计制备针对miR-1826的3组不同inhibitor序列,以最佳转染条件转染细胞后采用qRT-PCR验证干扰效果并进而筛选出最佳干扰片段以备后续实验用。4、将先前筛选出的最佳干扰片段miR-1826inhibitor按最佳转染条件对miR-1826高表达细胞株SW480进行转染干扰,再分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,流式细胞术(FCM),侵袭实验,迁移实验检测inhibitor干扰miR-1826后对大肠癌SW480细胞增殖,凋亡、周期及侵袭、迁移性的影响。　　结果:1.癌旁组织中miR-1826的表达水平明显低于肿瘤组织(P<0.001)。miR-1826在5株结直肠癌细胞中均有不同程度的表达,在SW480细胞株中表达水平最高。2.生存分析显示高表达的miR-1826跟大肠癌患者预后负相关(P<0.05),并跟大肠癌的不良预后指标如淋巴结转移(P=0.018)和TMN分期(P=0.004)正相关。COX线性回归分析显示miR-1826表达为大肠癌中一项独立的预后影响因素(P=0.043)。3.细胞数约为每孔1.5×105个、inhibitor浓度约为80pmol,Lipofectamine20与inhibitor比例为6ul:8ul(6孔板)时,有较佳的转染效率,继续提高inhibitor浓度并不能明显提高转染效率。将三组inhibitor转染细胞后miR-1826表达量均有不同程度下降,其中以miR-1826 inhibitor2干扰效果最明显,转染细胞后miR-1826表达水平明显下降。4.转染了miR-1826inhibitor的大肠癌细胞SW480细胞株吸光度值降低,增殖活力下降,生长缓慢,细胞凋亡增加,且大部分停留在G0/G1期,同时,细胞的侵袭和迁移性减低。　　结论:miR-1826在大肠癌中高表达,且跟大肠癌患者生存时间负相关,并为大肠癌中一项独立的预后影响因素。转染miRNA inhibitor能使miR-1826表达明显干扰下调,进而抑制大肠癌细胞株SW480增殖并加速其凋亡,其周期大部分阻滞于G0/G1期,同时其细胞的侵袭和迁移性减低。提示miR-1826可能在大肠癌发生发展中扮演着重要角色,过表达的miR-1826或成为一种新的大肠癌预后标志物并有可能为靶向治疗大肠癌提供一个新的策略。

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引言

第一部分 miR-1826在大肠癌中的表达及其临床意义

材料和方法

1. 大肠癌标本及其相关临床资料的收集

2. 细胞及培养基

3. 主要试剂

4. 主要仪器和设备

5. 实验方法

6．统计分析

结果

1．MiR-1826在大肠癌组织中的表达水平及其和患者生存时间的关系

2．MiR-1826表达水平和72例大肠癌患者各项临床病理参数之间的关系

表1-5 miR-1826在72例大肠癌患者中的表达水平和临床病理的关系因素

3．单因素和多因素分析验证miR-1826及其他临床参数为72例大肠癌患者的预后独立影响因子

4．SW480细胞株在五株大肠癌细胞株中miR-1826表达水平最高

5．电泳验证扩增产物

讨论

结论

第二部分 干扰下调SW480细胞株中 miR-1826表达对细胞增殖、凋亡、周期及侵袭迁移的影响

材料和方法

1. 细胞和培养基

2.主要试剂

3. 主要仪器和设备

4. 实验方法

5. 统计学分析

结果

1. 流式细胞仪检测转染效率和最佳转染条件

2. SYBR GREEN染色法定量PCR检测miR-1826 inhibitor 转染后SW480细胞株的 miR-1826表达水平

3．下调miR-1826表达水平对大肠癌细胞SW480增殖能力的影响

4. 下调miR-1826表达水平对大肠癌细胞SW480周期和凋亡的影响

5．下调miR-1826表达水平对SW480细胞侵袭和迁移能力的影响

6．miR-1826的预测靶基因

讨论

结论

全文总结

参考文献

综述

全文缩略词

攻读学位期间公开发表的论文

致谢