蜡质芽胞杆菌AR156生防功能基因和调控生物膜形成功能基因研究

摘要

本实验室前期筛选得到的蜡质芽胞杆菌AR156能够用于防治多种病原真菌、细菌以及线虫等引起的土传病害，对多种作物具有显著的增产效果。目前已经完成了全基因组测序，便于进行遗传功能基因分析。AR156在温室和田间具有较好的生物防治效果，但是AR156是怎样发挥生防作用，含有哪些与生防功能相关的基因，我们还不清楚。本研究利用miniTn10转座子构建了AR156的随机突变体文库，通过拮抗，产胞外酶和嗜铁素等代谢产物活性，温室和定殖试验筛选得到了与AR156中和生防功能相关的基因。同时我们发现AR156与枯草芽胞杆菌类似，能在气液界面形成生物膜，本文第一次表述了蜡质芽胞杆菌在气液界面生物膜的形成模式。本文通过构建突变体文库，筛选得到了50个和生物膜相关的基因，其中大部分基因都是第一次被报道和生物膜形成相关。表型分析发现comER不仅能够影响蜡质芽胞杆菌的生物膜形成，游动性，芽胞形成，而且这种现象在枯草芽胞杆菌中是保守的。　　1.蜡质芽胞杆菌AR156与生防相关功能基因研究　　蜡质芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种广泛分布于土壤、空气等环境中的革兰氏阳性杆状细菌。蜡质芽胞杆菌能够作为微生物制剂用于防治植物病原细菌、真菌和线虫引起的植物病害。蜡质芽胞杆菌AR156能够用于防治多种土传病害，且已经完成了全基因组测序，其作用机理尚不清楚。本研究中采用转座子miniTn10构建了AR156的随机插入突变体文库，通过拮抗、产胞外酶和嗜铁素、温室试验以及植物根系定殖能力筛选AR156中与生防能力相关的突变体，并鉴定相关功能基因。结果表明，M-60 protein，modA，peptide synthetase等基因在蜡质芽胞杆菌AR156发挥生防作用过程中具有重要作用。　　2.蜡质芽胞杆菌生物膜形成相关基因的功能分析　　蜡质芽胞杆菌是一种能够形成芽胞的革兰氏阳性菌，与多数其它革兰氏阳性菌相似，能够在生物或者非生物界面形成生物膜。生物膜的形成是一个非常重要的细菌多细胞行为。与枯草芽胞杆菌相比，蜡质芽胞杆菌形成的生物膜缺乏很好的研究，其参与生物膜形成的基因在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们发现LBGM培养基能够诱导蜡质芽胞杆菌生物膜的形成，并利用RNA-seq分析了AR156在LB和LBGM中蜡质芽胞杆菌中基因的表达差异。同时构建miniTn10随机插入转座子文库，筛选并鉴定了约50个能够影响生物膜形成，芽胞形成以及游动性的突变体。其中许多鉴定出的插入位点在蜡质芽胞杆菌的多细胞行为中的作用没有被报告过。值得注意的是，我们发现purD，purH，和guaB参与嘌呤生物合成的基因突变体的生物膜形成能力受到影响，且Fe在生物膜的形成过程中是必不可少的。研究结果还显示，挥发性小分子能够诱导生物膜形成。　　3.comER基因对蜡质芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌多细胞行为表征的研究　　浮游细胞的自由生长、芽胞的形成、游动性以及生物膜形成是细菌生长的集中生命活动过程。本研究通过突变体文库的筛选得到了一个对蜡质芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌生物膜形成、芽胞形成以及游动性的过程中发挥重要作用的基因——comER。研究结果表明在这两种芽胞杆菌中，comER的缺失可以导致生物膜形成受损、游动性降低、产胞过程的延迟。生物膜形成受损和延迟产胞的现象主要是由于comER可能参与主效调控因子Spo0A的活化。通过MS分析研究表明，在蜡质芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌的comER基因的突变体中，磷酸转移蛋白Spo0F水平显著低于野生型中的水平，而Spo0F对Spo0A的磷酸化并激活Spo0A至关重要。同时， comER通过降低SigD的活性导致游动性减弱，目前，具体的调控机制尚不清楚。

目录

声明

论文说明

摘要

上篇 文献综述

第一章 蜡质芽胞杆菌防病促生机理研究概述

1 国内外蜡质芽胞杆菌研究现状

2 蜡质芽胞杆菌主要生防机理

3 应用前景与存在问题

参考文献

第二章 微生物生物膜的形成、调控及生活史

1 细菌生物膜

2 植物与细菌之间的相互作用

参考文献

第三章 细菌挥发性物质及其功能研究进展

1 BVC的合成和生物活性

2 挥发性物质的分离与分析

3 挥发性物质的作用

4 BVC对临床医学的影响

5 挥发性物质在农业上的应用

参考文献

下篇 研究内容

第四章 蜡质芽胞杆菌AR156与生防相关功能基因研究

1 材料与方法

2 结果

3 结论与讨论

参考文献

第五章 蜡质芽胞杆菌AR156生物膜形成相关基因功能分析

1 材料与方法

2 结果

3 结论与讨论

参考文献

第六章 comER基因对蜡质芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌多细胞行为的研究

1 材料与方法

2 结果

3 结论与讨论

参考文献

全文总结

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