鸡MHCⅡα/β链基因的克隆和原核表达及其抗体制备

摘要

主要组织相容性复合体(MHC)是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的位于染色体上一个遗传区域，广泛存在于所有脊椎动物，具有高度的多态性和保守性。该基因区编码的蛋白通常称为MHC分子或MHC抗原，是移植物排斥的主要决定簇。其中，MHCⅡ类分子是由2条非共价结合的多肽链(α链和β链)构成的糖蛋白，它们由不同的MHC基因编码。α链(32000～34000)比β链(29000～32000)略大，2条链均含有寡糖，α链糖基化程度较高。　　为了探索鸡MHCⅡ类分子在免疫应答中的作用及其机理，本研究运用分子生物学技术，进行了克隆、表达和鉴定。　　首先，根据GenBank中登录的鸡类MHCⅡ的α链和β链基因序列与载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点分别设计两对引物，利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从有丝分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激18h活化的鸡脾淋巴细胞中扩增出相应大小的α链(771bp)和β链(798bp)的基因；然后将这两个片段分别插入载体pGEX-4T-1中，并转化宿主菌BL21，经双酶切鉴定重组质粒pGEX-4T-1/α和pGEX-4T-1/β后，对α链和β链的核苷酸序列进行测定。　　其次，将上述构建成功的原核表达重组质粒pGEX-4T-1/α和pGEX-4T-1/β，转化大肠杆菌BL21，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃诱导培养4h，表达出含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白GST-α和GST-β；对表达条件进行相应的优化，确定了最佳诱导表达时间和诱导剂浓度；对表达蛋白的可溶性进行鉴定。　　最后，利用上述纯化的GST-α和GST-β融合蛋白作为抗原分别免疫小鼠制备鼠抗鸡α链和β链多克隆抗体。琼脂扩散实验和ELISA实验表明制备的两种多抗均具有良好的抗原性。　　综上所述，本研究成功地克隆了鸡的Ⅱ类MHC的α链和β链基因，构建了原核表达质粒，并进行了原核蛋白表达和纯化，并制备了效价高、反应性和特异性强的鼠源抗鸡Ⅱ类MHC的α链和β链多克隆抗体，为进一步研究鸡的Ⅱ类MHC基因的免疫功能和生物学活性奠定了基础。关键词：鸡MHCⅡα/β链克隆原核表达多抗制备

目录

文摘

英文文摘

论文说明：插图和附表清单,本论文常用中英文缩写词

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1文献综述

2引言

3材料与方法

3.1实验动物

3.2质粒和菌种

3.3主要工具酶及试剂

3.4主要溶液的配制

3.5实验仪器

3.6鸡MHC Ⅱ基因cDNA的提取

3.7鸡MHC Ⅱα和β基因的原核表达质粒构建和克隆

3.8鸡MHC Ⅱα和β基因的原核表达与鉴定

3.9 GST-α和GST-β融合蛋白的大量提取与纯化

3.10 GST-α和GST-β融合蛋白的定量(Folin-酚法则蛋白浓度)

3.11鼠抗鸡MHC Ⅱα和β多克隆及鉴定抗体的制备

4结果与分析

4.1鸡MHC Ⅱα和β基因的克隆与鉴定

4.1.1提取鸡脾淋巴细胞中的总RNA

4.1.2 RT-PCR扩增的鸡MHC Ⅱα和β基因

4.1.3鸡MHC Ⅱα和β基因RT-PCR产物的单酶切鉴定

4.1.4鸡MHC Ⅱα和β基因的克隆与重组质粒pGEX-4T-1的双酶切鉴定

4.1.5重组质粒pGEX-4T-1/α和β中α和β基因的DNA序列测定

4.2 GST-MHC Ⅱ融合蛋白的提取与纯化

4.2.1 SDS-PAGE检测诱导表达的融合蛋白

4.2.2 GST-MHCⅡ融合蛋白的可溶性鉴定

4.3 GST-MHCⅡ融合蛋白的提取与纯化

4.3.1 pGEX-4T-1/MHCⅡ诱导表达的条件优化

4.3.2 GST/MHCⅡ融合蛋白的大量提取结果

4.3.3 GST/MHCⅡ融合蛋白的纯化结果

4.3.4 GST/MHCⅡ融合蛋白的浓度测定

4.4鼠抗鸡MHCⅡ多克隆抗体的鉴定结果

5讨论

6结论

参考文献

附录

致谢

作者简介