IBDV-VP2基因部分片段的克隆与表达及其鉴定

摘要

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引起鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。自1957年Cosgrove首次报道该病以来，便出现世界性的流行特点，相继流行于三十多个国家，尤其在养禽业发达的地区，1979年传入我国北京、广州、上海等地区，随后发生于全国各地，造成了严重的经济损失，尽管我国投入了大量的人力、物力，采取了控制与扑灭该病的措施，但由于超强毒株和变异株的出现，传染性法氏囊病迄今仍然是威胁养禽业的头号传染病。 传染性法氏囊病毒主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，破坏法氏囊中的B淋巴细胞，引起免疫抑制，因此，很容易和其它疾病联合感染，出现亚临床症状，给临床诊断带来不便。 为了建立一个准确快速的诊断方法，分析我国目前使用的疫苗株的抗原基因是否发生了变异，本研究初步建立了检测IBDV的RT-PCR方法、获得了VP2蛋白的抗原决定区域的基因，构建了该基因的重组质粒，并且成功表达了VP2基因的部分片段。 首先，根据Gen Bank中已登录的传染性法氏囊病毒VP2基因序列和在前人研究成果的基础上，设计了含酶切位点和保护性碱基的一对引物，P<,1>：5′-CGGAATTCACAGGGCTAAT-3′；P<,2>：5′-GCGTCGACTGCTAGTTCAGGATTTGG-3′。以弱毒疫苗灭菌生理盐水稀释液为毒种，SPF鸡胚接种法增殖IBDV病毒，再以在鸡胚上已盲传三代的尿囊液接种鸡胚成纤维细胞，分别以尿囊液和细胞液离心后的沉淀物为材料，采用Trizol试剂法提取病毒的总RNA，进行RT-PCR，实验证明以尿囊液和成纤维细胞培养液离心后的沉淀物提取的病毒总RNA均可作为RT-PCR的模板，均能够扩增出大小为987bp的基因片段(记为P<,12>)，与预期的结果一致。利用DNAStar软件分析已登录序列片段中的酶切位点，经单酶切鉴定后，将其插入到质粒载体PET-32a上，转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR筛选阳性克隆和质粒PCR及双酶切鉴定后测序。序列分析表明，P<,12>与登录号为．DQ202329、AY321509的中国毒株的同源性分别为99.8％、99.2％，与登录号为AJ621158、AJ577092、和AF508177的国外毒株的同源性分别为97.3％、99.3％、和94.8％，这表明本实验已成功地扩增了目的基因，为建立检测IBDV的RT-PCR方法奠定基础。 其次，根据GenBank中登录的传染性法氏囊病毒基因序列及原核表达质粒pGEX-4T-1的多克隆位点，设计了另一条原核表达引物，P<,3>：5′-GCGTCGACCTGTGATGAGAATTGGT-3′。为了便于基因的克隆与表达，我们在引物的5’端添加了酶切位点及其保护碱基。以己构建的重组质粒为模板，P<,1>、P<,3>分别为上下游引物，扩增504bp的原核表达目的片段(记为P<,13>)，将其插入到表达载体PGEX-4T-1上，转入大肠杆菌DH5α，经菌液PCR筛选阳性克隆、双酶切鉴定后，将抽提的重组质粒转入大肠杆菌BL<,21>，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测后，所表达的蛋白大小与预期结果一致。综上所述，本研究用两种方法增殖了传染性法氏囊病毒，克隆了包括中和抗原表位在内的部分VP2基因，并且成功表达了部分VP2基因片段，为RT-PCR方法的建立和基因工程疫苗的制备都打下了一定的实验基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：插图和附表清单、主要符号表

声明

文献综述

引言

1.材料与方法

1.1实验鸡胚

1.2质粒和菌种

1.3病毒和细胞

1.4酶类及相关试剂

1.5培养基

1.6常用溶液配制

1.7主要仪器

1.8 传染性法氏囊病毒部分VP2基因的克隆及序列比较

1.8.1引物设计

1.8.2病毒的增值

1.8.3病毒RNA的抽提

1.8.4反转录合成第一链cDNA

1.8.5片段P12的PCR扩增及其初步鉴定

1.8.6 RT-PCR产物的回收与纯化

1.8.7 RT-PCR产物的单酶切鉴定

1.8.8 PET-32a-P12重组质粒的构建与鉴定

1.8.9 RT-PCR产物的序列测定与序列分析

1.9 IBDV部分VP2基因的原核表达

1.9.1表达片段的PCR扩增

1.9.2 PCR产物的回收与纯化

1.9.3 原核表达重组质粒PGEX-4T-1-P13的构建与鉴定

1.9.4 pGEX-4T-1-P13的原核表达

2.结果与分析

2.1 IBDV部分VP2基因的克隆及序列比较

2.1.1病毒的增殖

2.1.2病毒总RNA的提取

2.1.3 RT-PCR扩增目的基因P12

2.1.4 P12目的基因的单酶切鉴定

2.1.5菌液PCR鉴定阳性克隆

2.1.6重组质粒的PCR鉴定及双酶切鉴定

2.1.7 P12基因的序列测定

2.1.8 P12基因核苷酸序列的同源性比较

2.2 IBDV部分VP2基因的原核表达

2.2.1原核表达片段P13的扩增

2.2.2重组质粒PGEX-4T-1-P13鉴定

2.3重组质粒PGEX-4T-1-P13的原核表达

2.3.1 PGEX-4T-1-P13原核表达蛋白的鉴定

2.3.2 原核表达重组质粒PGEX-4T-1-P13最佳诱导时间的确定

2.3.3 原核表达重组质粒PGEX-4T-1-P13最佳诱导浓度的确定

3.讨论

3.1 IBDV的增殖及其RNA的提取

3.2传染性法氏囊病毒P12片段的扩增

3.2.1引物的设计

3.2.2 RT-PCR的扩增

3.2.3 PCR条件的优化

3.2.4克隆载体的选择

3.3表达系统的选择

3.4表达载体及宿主菌的选择

4.结论

参考文献

致谢

附录

作者简介