小鼠体外受精胚与体内胚Oct4基因启动子区DNA甲基化差异的研究

摘要

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要形式之一，对哺乳动物的正常发育至关重要。体细胞中DNA甲基化模式是稳定的，但在早期胚胎中：DNA会发生去甲基化和再甲基化。Oct4是一种与胚胎发育相关的多能调控因子，它在建立和维持细胞多能性方面起着重要作用。本试验以Oct4基因作为候选基因，运用亚硫酸氢盐测序法，对小鼠体细胞、生殖细胞以及早期胚胎发育过程中各个时期Dct4启动子区甲基化进行检测，并对其在体内和体外受精 (in vitro fellilization，IVF)胚中的甲基化进行比较。 试验的各种检测材料经低熔点琼脂糖包埋、亚硫酸氢盐变性处理后进行巢式PCR扩增，然后将PCR产物进行纯化、连接、转化于感受态大肠杆菌中。对转化后的菌体进行菌体PCR鉴定，将有特异性条带的菌液送检测序。对测序结果进行分析的结果表明：(1)体细胞基因组中Oct4启动子区呈高度甲基化状态(73.8±5.9％，平均数±标准差)，极显著高于精子和卵子(P<0.01)；精子和卵子之间甲基化水平也存在显著差异(P<0.05)，精子中略微甲基化(18.75±4.1％)，而卵子中基本上是非甲基化的(2.5±1.4％)。(2)小鼠体内各时期胚胎Oct4启动子区均呈低甲基化状态，2-细胞、4-细胞、8-/16-细胞和桑椹胚时期甲基化水平分别为5.63±2.5％、4.38±2.0％、3.75±1.4％、1.88±0.2％，甲基化逐渐丢失，但无显著性差异(P>0.05)；而在囊胚期，Oct4启动子区甲基化水平显著升高(6.88±2.4％，P<0.05)，重新甲基化开始。(3)小鼠体外受精胚与体内胚甲基化模式相似，其各时期胚胎Oct4启动子区也呈低甲基化状态，从2-细胞至桑椹胚，随着胚胎发育而呈下降趋势，相互之间差异不显著(P>0.05)，分别为11.25±4.5％(2-细胞)、6.25±2.1％(4-细胞)、5.63±3.7％(8-16-细胞)、1.88±0.2％(桑椹胚)；而在囊胚期，甲基化水平显著升高(7.5±2.4％，P<0.05)。(4)对比体外与体内各时期胚胎Oct4启动子区甲基化水平，体外2-细胞胚甲基化水平显著高于体内2-细胞胚(P<0.05)，其余各时期胚胎虽均高于体内胚，但相互之间无显著性差异。 试验结果表明：小鼠体外受精胚在早期发育过程中也能发生较有效的重编程，所构建的胚胎部分可以发育至囊胚，但其各个时期的甲基化水平均要高于相应时期的体内胚，尤其在2-细胞期，这可能是造成体外受精胚发育到期的比例低于体内受精胚的原因。

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文摘

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论文说明：缩略词表

声明

第一章文献综述

第二章试验研究

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3数据分析

3结果与分析

3.1小鼠Oct4基因启动子区PCR扩增结果

3.2小鼠Oct4基因启动子区克隆与测序

3.3小鼠Oct4基因启动子区甲基化

4讨论

4.1小鼠体细胞与生殖细胞中Oct4基因启动子区甲基化分析

4.2小鼠体内胚Oct4基因启动子区甲基化分析

4.3小鼠体外胚Oct4基因启动子区甲基化分析

4.4小鼠体内与体外胚Oct4基因启动子区甲基化差异分析

5结论

参考文献

致谢

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