多重PCR检测禽致病性大肠杆菌毒力基因方法的建立及应用

摘要

随着养禽业迅速发展，各类细菌性疾病日益严重，特别是大肠杆菌病一直是限制养禽业发展的最主要的疾病之一。为建立一种特异性的禽大肠杆菌病检测方法，本实验根据GeneBank收录的APEC毒力基因papC、iucD、tsh、irp2、iss序列的保守区，设计并合成5对特异性引物，建立一种同时检测APEC 5种毒力基因的多重PCR方法，并应用此方法检测APEC安徽分离株的毒力基因。结果如下： 1．APECdOpapC、iucD、irp2、tsh、iss单基因PCR扩增 根据APEC的致病机理，从细菌的粘附定居、参与铁摄取和增强血清抗性等方面考虑，参照GeneBank收录的禽致病性大肠杆菌P型菌毛基因papC、产气杆菌素基因iucD、温度敏感性血凝素基因tsh、铁抑制蛋白基因irp2、血清抗性蛋白基因iss的序列，设计并合成5对特异性引物。以E．coli O<,1>(CVCC249)、O<,2>(CVCC1565)、O<,78>(CVCC1555)标准菌株的DNA为模板，将5种基因分别进行单基因PCR扩增，以筛选多重PCR的阳性对照。经过预实验得到的PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，MgCl<,2>(25mM)3.0μL，dNTP(10mM)1.0μL，引物各0.5μL(10pmol)，Taq DNA聚合酶(5U·μL<'-10>)0.4gL，DNA模板2.0μL，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应参数为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸3min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。结果3种血清型的菌株中5种基因的检出率均为100％，因此均可用做阳性对照的模板。选择其中一种血清型菌株E．coliO<,2>(CVCC1565)，对从中扩增出的5种基因进行核苷酸序列测定，并提呈NCBI BLAST 2 SEQUENCES，与GeneBank中公布的进行基因同源性分析。结果显示所得的片段与预计的基本一致，且同源性在98％～99％。 2．APEC中papC、iucD、irp2、tsh、iss多重PCR方法的建立 根据单基因PCR扩增条件，通过逐步优化引物组合浓度、镁离子浓度、TaqDNA聚合酶量、退火温度、延伸时间、循环次数和DNA模板提取方法等条件，建立了同时检测5种毒力基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR反应体系为25μL，包括2.5μL 10×PCR缓冲液，2.5μLMgCl<,2>(25mM)，1.0μLdNTP(10mM)，0.5μL引物(10pmol)，0.5μLTaq DNA聚合酶(5U·μL<'-1>)，2.0μL LDNA模板，加灭菌超纯水至25μL。PCR反应参数为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸3min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。菌液最低检出浓度为10<'2>cfu·mL<'-1>，且具有特异性。 3．APEC安徽分离株毒力基因的多重PCR检测 应用所建立的多重PCR方法检测了9株APEC安徽分离株，以验证所建立的多重PCR方法的实用性，并确定了9株APEC安徽分离株的毒力基因型。分别提取各分离株的基因组DNA作为模板，进行papC、tsh、iucD、irp2和iss基因的多重PCR扩增。结果1株鸭源和3株鸡源的APEC中均扩增出4条毒力基因条带，1株鹅源和4株鸡源的APEC中均扩增出5条毒力基因条带。在9株APEC安徽分离株中iss、irp2、papC和iucD基因的携带率均为100％，tsh基因的携带率为55.6％。9株APEC安徽分离株分布于两个毒力基因型，其中5株为iss<'+>irp2<'+>papC<'+>iucD<'+>tsh<'+>，占55.6％；4株为iss<'+>irp2<'+>papC<'+>iucD<'+>tsh<'->，占44.4％。表明iss、irp2、papC和iucD基因广泛存在于APEC中。 以上研究表明，本文建立的多重PCR方法可从APEC分离菌株中检测出任何一种或任何组合的毒力基因，其特异性强，准确性好，敏感度可以达到10<'2>cfu·mL<'-1>。因此，本方法在禽大肠杆菌病的早期诊断、分子流行病学调查和禽制品APEC污染的检测中具有重要的应用价值，为进一步从分子水平揭示APEC的致病机制提供研究基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照表

文献综述

1引言

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验菌株

2.1.2培养基及常规试剂

2.1.3分子生物学试剂

2.1.4主要仪器

2.2实验方法

2.2.1 APEC中papC、iucD、irp2、tsh、iss单基因PCR扩增

2.2.2 papC、iucD、irp2、tsh、iss多重PCR条件的优化

2.2.3多重PCR敏感性实验

2.2.4多重PCR特异性实验

2.2.5 APEC安徽分离株毒力基因的多重PCR检测

3结果与分析

3.1 papC、iucD、irp2、tsh、iss单基因PCR扩增结果

3.1.1 papC基因的PCR扩增

3.1.2 iucD基因的PCR扩增

3.1.3 irp2基因的PCR扩增

3.1.4 tsh基因的PCR扩增

3.1.5 iss基因的PCR扩增

3.1.6 5种基因的单基因PCR扩增结果

3.2 papC、iucD、irp2、tsh、iss基因测序与同源性比较

3.2.1 papC基因的PCR产物序列与同源性比较

3.2.2 iucD基因的PCR产物序列与同源性比较

3.2.3 irp2基因的PCR产物序列与同源性比较

3.2.4 tsh基因的PCR产物序列与同源性比较

3.2.5iss基因的PCR产物序列与同源性比较

3.3多重PCR反应条件的优化结果

3.3.1引物浓度的优化结果

3.3.2镁离子浓度的优化结果

3.3.3 Taq酶量的优化结果

3.3.4退火温度的优化结果

3.3.5延伸时间的优化结果

3.3.6循环次数的优化结果

3.3.7 DNA提取方法的比较结果

3.3.8优化后的多重PCR条件

3.4多重PCR敏感性实验结果

3.5多重PCR特异性实验结果

3.6 APEC安徽分离株毒力基因的多重PCR检测结果

4讨论

4.1禽致病性大肠杆菌毒力基因与致病性的关系

4.2多重PCR条件优化

4.3禽致病性大肠杆菌毒力基因的测序

4.4禽致病性大肠杆菌安徽分离株的毒力基因分布

5结论

参考文献

致谢

作者简介