应用ISSR分子标记对雁鹅遗传多样性的研究

摘要

雁鹅原产于安徽省六安地区,现主要分布于安徽省宣城市郎溪县境内,是我国现存的极其珍稀的中型灰鹅品种,已被农业部列为重点保护的地方品种。 简单重复序列区间(Inter-simple sequence repeat, ISSR)标记技术最早是Zietkiewicz(1994)提出的一种简单重复序列区间扩增多态性分子标记。它是在SSR(Simple sequence repeat, SSR)的基础上发展起来的,以PCR技术为基础,利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物,无需预先克隆和测序,从而对位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增,扩增的产物经电泳分离获得多态性图谱。该实验技术成本低,特异性强,实验稳定性较高,所需DNA量少,引物设计比SSR简单,不需要知道SSR两端的碱基序列,多态性高。 本试验以来自安徽省郎溪县雁鹅原种鹅场的雁鹅为研究材料,应用ISSR技术对雁鹅种群的谱系和遗传多样性进行了探讨。本研究的结果将在分子水平上的提供雁鹅种质特性的有关资料,并且可在一定程度上应用于雁鹅保护的实际工作。所得结果如下： (1)建立了雁鹅ISSR-PCR分子标记技术最佳反应体系。以雁鹅基因组DNA为模板,采用正交设计L25(55)对PCR反应中5个因素(引物、dNTPs浓度、模板DNA、Mg2+、TapDNA聚合酶)在5个水平上进行优化实验,在初步实验的基础上通过因素内比较进一步优化各因素在ISSR-PCR反应中的浓度。在25μL的反应体系中,ISSR引物的浓度为0.20μmol/L,dNTPs浓度为0.28mmol/L,模板DNA的用量为40ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,TaqDNA聚合酶的用量为1.0U。扩增程序为94℃变性5min,进行下列35个温度循环：94℃变性1min,退火温度(55℃左右)1min,72℃延伸1min,最后在72℃延伸10min,扩增产物在4℃保存。 (2)对各个引物最佳反应体系确立之后,筛选出43个ISSR引物,对94个供试样本进行了扩增,共扩增出216个位点,每条引物扩增出的谱带数在2～7之间,平均为5.0条；各谱带分子量在150bp～2000bp之间。43条引物扩增出的多态性条带共计145条,占总带数的67.13％,多态条带比率在16.67～100％之间,平均为65.60％。 (3)根据ISSR图谱计算任意两个个体之间的相似性系数和遗传距离,构建了由94只个体组成的雁鹅种群的遗传距离矩阵,并根据该矩阵,用不加权算术平均组对法(Unweighted pair group mothed with arithmeticmean, UPGMA)对94个个体间的关系进行聚类分析,由此构建了雁鹅种群的谱系图。 (4)本研究首次采用ISSR这一核基因DNA标记技术对雁鹅群体遗传变异进行了分析研究。ISSR-PCR扩增产物在雁鹅种群表现出高度的稳定性,并检测到比RAPD等其它分子标记更多的多态位点。在整个实验过程中,也较少出现由于随机因素造成扩增反应不稳定的情况,这充分说明ISSR技术用于分析雁鹅的遗传多样性是可行的,而且具有简便快捷、成本低等特点,可为其在雁鹅种质资源研究与辅助育种中的应用提供直接的试验证据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:图表目录、论文中出现的中英文缩写词

声明

文献综述

1雁鹅简介

1.1外貌特征

1.2生产性能

1.3雁鹅的研究现状

2遗传多样性简介

2.1遗传多样性的含义

2.2研究遗传多样性的意义

2.3遗传多样性的分子生物学研究方法

3 ISSR分子标记技术原理及其应用

3.1 ISSR分子标记技术原理及特点

3.2 ISSR分子标记技术的应用

4鹅业生产、研究现状及展望

4.1饲养现状

4.2研究现状

4.3鹅业生产及研究展望

引言

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

1.2雁鹅基因组DNA的提取及检测

1.2.1提取

1.2.2 DNA浓度侧定

1.3雁鹅基因组DNA的PCR扩增

1.3.1 ISSR-PCR反应条件优化

1.3.2引物的筛选

1.4电泳检测扩增产物

1.5 ISSR结果的记录与分析

1.5.1谱带记录

1.5.2数据分析

1.5.3计算公式和理论

1.5.4处理RAPD数据的软件

2试验结果

2.1雁鹅基因组DNA提取结果

2.2扩增条件优化的结果

2.2.1引物浓度对ISSR-PCR的影响

2.2.2dNTPs浓度对ISSR-PCR的影响

2.2.3模板浓度对ISSR-PCR的影响

2.2.4 Mg2+浓度对ISSR-PCR的影响

2.2.5TaqDNA聚合酶对ISSR-PCR的影响

2.2.6循环次数及退火温度对ISSR-PCR的影响

2.2.7雁鹅ISSR-PCR最佳反应条件

2.3引物筛选结果

2.4 43条引物扩增谱带的多态性比率

2.5相似性系数和遗传距离的计算

2.6用UPGMA法构建朱鹊种群的谱系

3讨论

3.1 ISSR技术

3.2实验中应注意的问题

3.2.1 PCR扩增

3.2.2电泳

3.3雁鹅种群的遗传多样性

3.4 UPGMA法聚类结果分析

3.5有待进一步进行的研究

4结论

参考文献

致谢

附录：供试94只雁鹅欧氏距离表

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