引起鸡肝炎-心包积液综合征禽腺病毒4型中国流行株的分离鉴定及灭活疫苗的研制

摘要

肝炎-心包积液综合征（Hepatitis and Hydropericardium Syndrome，HHS）是一种家禽急性传染性疾病，严重影响养禽业的发展。2015年6月份以来，中国暴发由禽腺病毒4型(Fowl Aviadenovirus4，FAdV-4)新基因型引起的HHS，对中国养禽业造成很大损失。目前该病仍不断发生，市场上尚无正规商品化疫苗进行预防，并且对疫苗的免疫反应缺乏客观的评价方法。本研究从河南及周边各省采集患病鸡只肝脏，进行病毒分离鉴定和基因组序列测定与分析，研究分离毒株的生物学特性;建立基于FAdV-4中国流行株间接ELISA抗体的检测方法;制备基于FAdV-4中国流行株的油乳剂灭活疫苗，对疫苗的免疫原性和免疫效力进行评价，研究内容包括以下4个方面:　　1.FAdV-4中国流行株分离鉴定与基因进化分析　　本研究从河南、山东、山西、安徽和江苏等省份暴发HHS的鸡场采集样品，进行病毒分离并测定五株分离株的全基因组序列。通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析及病毒的系统进化分析。结果显示，中国流行株与早期的致病和非致病毒株相比，FAdV-4中国流行毒株基因组右端存在1966bp的缺失，这一缺失直接导致了ORF19、27和48的消失;Hexon、Penton、Fiber蛋白均在特定位置发生氨基酸残基的替换;进化树分析显示，分离自世界各地HHS病鸡的FAdV-4亲缘关系较近，均在同一进化分支，而非致病毒株集中在另一分支。引起本次肝炎-心包积液综合征的FAdV-4为新基因型。　　2.FAdV-4中国流行毒株CH/HNJZ/2015生物学特性研究　　为进一步了解FAdV-4中国流行毒株CH/HNJZ/2015生物学特性，利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR和病毒滴度测定方法，研究该毒株在鸡肝癌上皮细胞系(LMH)中的生长特性和增殖规律。结果显示FAdV-4中国流行株在LMH中能够很好增殖，不同时间点的病毒滴度与病毒基因组拷贝数呈正相关，病毒感染后60h滴度最高，且培养上清中亦含有大量成熟的病毒粒子;将毒价为107TCID50的FAdV-4中国流行株CH/HNJZ/2015经肌肉注射途径感染3周龄SPF鸡，死亡率100％，采集组织器官制备病理切片进行HE染色和免疫组化，结果显示攻毒鸡各组织器官均有不同程度的损伤，肝脏、心脏、脾脏、腺胃和小肠组织中均有病毒抗原，证明该分离株为强毒株。　　3.基于FAdV-4中国流行株间接ELISA方法的建立与应用　　为建立一种客观评价鸡群中FAdV-4流行毒株感染情况和FAdV-4全病毒灭活疫苗免疫后抗体反应的简便、快速和特异的方法，本研究利用纯化的禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株作为包被抗原，建立了检测FAdV-4流行株抗体的间接ELISA方法，并对各种检测条件进行了优化。优化后的反应条件为:抗原的最佳包被量为0.20μg/孔;包被条件为37℃1h，然后4℃过夜;血清稀释度为1∶800，酶标二抗最适稀释度为1∶2000，作用时间为1.5h;TMB作用时间为5min。在优化条件下，样品的S/P值大于或等于0.073时判定为阳性。FAdV-4抗原与抗新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清均无交叉反应，表明该方法有较好的特异性;批内和批间重复的最大变异系数分别为3.864％和3.924％，显示该方法具有较好的稳定性，用所建立的ELISA对40份来自于疑似FAdV-4感染病鸡的血清样品进行检测，检测结果与FAdV-4病原学检测结果符合率为100％。对中国河南、山东、安徽、山西和江苏等不同地区的676份鸡血清样品进行了FAdV-4感染的血清流行病学调查，结果显示上述省份均存在不同程度的FAdV-4感染，抗体阳性率在69.3-89.1％。　　4.基于FAdV-4中国流行株灭活疫苗的研制与评价　　为有效防控HHS在中国的流行，本研究利用LMH细胞对FAdV-4中国流行株进行增殖，制备油乳剂灭活疫苗。用不同剂量的灭活疫苗接种7日龄SPF肉鸡，检测疫苗免疫鸡的FAdV-4特异性抗体水平和中和抗体，分析疫苗免疫原性。在免疫后2周对免疫鸡用103TCID50/鸡的FAdV-4中国流行株经肌肉注射途径攻毒，以评价灭活疫苗的免疫效力。结果显示，不同剂量的疫苗免疫鸡均产生FAdV-4特异性抗体和中和抗体，抗体水平在免疫后2周开始上升，4周后达到高峰期，且在免疫后20周依然维持很高水平，各免疫组鸡在攻毒后均未表现HHS特征性临床症状和病理变化及死亡。本研究结果显示，基于FAdV-4中国流行株灭活疫苗能够有效防控由FAdV-4新基因型导致的HHS。

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英文缩写词表

摘要

1 禽腺病毒引起的相关疫病概述

2 禽腺病毒4型病原学研究进展

2．1 病毒形态学和理化特性

2．2 FAdV-4分子生物学研究进展

3 肝炎-心包积液综合征流行病学研究

4 FAdV-4实验室诊断方法

5 FAdV-4感染的防控

6 本研究的目的和意义

试验研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

试验二：禽腺病毒4型中国流行株CH／HNJZ.2015生物学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

试验三：基于FAdV-4中国流行株间接ELISA方法的建立与应用

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

试验四：基于FAdV-4中国流行株的灭活疫苗的研制与评价

1 材料与方法

2 结果

3 小结与讨论

全文总结

参考文献

附：作者读研期间发表文章