一株水产用益生芽孢杆菌的筛选及益生特性研究

摘要

近十年来，国内水产品的总产量持续上升，年产量已经连续三年超过六千万吨。研究发现，在养殖过程中，采用中草药、益生菌能够减少和降低抗生素的使用，有效降低水产养殖的药物残留风险。因此，近年来，水产养殖中抗生素替代的研究受到越来越广泛的关注。本研究拟筛选一株具有良好安全性和益生性的芽孢杆菌，并对养殖的效果及品质安全进行评价。主要研究结果如下：　　1.从洛阳南陈鱼塘采取的土样中分离获得一株对水产常见病原菌河流弧菌（Vibriofluviae）、嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）、哈维氏弧菌（vibrioharveyi）、溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）等6种菌具有良好抑菌效果的芽孢杆菌，该菌大小约为：0.762±0.076×2.37±0.351μM，菌落形态为椭圆形，乳白色，菌落表面粗糙不透明。经生理生化鉴定，并结合16SrDNA分析结果，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC17305。该菌株在3g/L淀粉、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠培养基中培养2小时进入快速生长期，8h进入稳定期，菌液浓度达到109CFU/mL。　　2.枯草芽孢杆菌CGMCC17305的安全性和益生特性研究。通过杯碟法研究该菌对甲砜霉素、硫酸新霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶钠、磺胺间甲氧嘧啶钠、氧氟沙星、盐酸林可霉素、硫酸庆大霉素、头孢曲松钠、诺氟沙星等水产常用抗生素药敏性，结果显示该菌对11种抗生素表现出明显的药敏性。黏附性试验表明，该菌在鱼肠的粘附率为42.05±0.14%，表明该菌可有效定植于水产动物肠道。在pH5的酸性环境下处理4h存活率为89±9.4%，其在浓度为0.9%的猪胆盐中处理4h仍有46.5±8.3%存活率，结果表明，该菌具有较强的抗逆性能。同时该菌还表现出蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等水解酶活性。　　3.水产养殖结果及品质安全性评价。将该菌制成浓度为100亿CFU/g的菌粉，按一定比例添加到水产养殖饲料中，以成活率、日增重、饵料系数、肥满度为养殖效果评价指标，研究了益生菌添加对罗非鱼和南美白对虾养殖的影响。结果显示，在饲料中添加1%菌粉，可有效改善罗非鱼和南美白对虾的生长性能。罗非鱼土塘养殖成活率为95%，显著高于对照组，日增重3.55g高于无添加组1.74g；饵料系数降低0.28；南美白对虾土塘养殖存活率高出对照组13%，日增重高出0.04g，饵料系数降低0.14。养殖结束后，对罗非鱼和南美白对虾进行药物残留检测，检测结果显示使用枯草芽孢杆菌CGMCC17305养殖的罗非鱼和南美白对虾，均未检出孔雀石绿、氯霉素、磺胺类、甲硝唑、土霉素等14种药物，有效确保饲养水产品的品质安全。

目录

声明

第1章 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 国内水产品消费现状

1.1.2 水产品存在的主要安全风险

1.1.3 国内外解决水产品药物残留的主要途径

1.2 本课题的研究内容及意义

1.2.1 研究内容

1.2.2 本课题的研究意义

第2章 益生芽孢杆菌的筛选与生长特性研究

2.1 材料和试剂

2.1.1 样品

2.1.2 试剂和仪器

2.1.3 培养基

2.1.4 菌种

2.2 试验方法

2.2.1 芽孢杆菌的分离

2.2.2 生理生化特征鉴定

2.2.3 分子生物学特性鉴定

2.2.4 候选菌株生长特性

2.3 结果分析

2.3.1 芽孢杆菌的筛选

2.3.2 生理生化鉴定

2.3.3 分子生物学鉴定

2.3.4 枯草芽孢杆菌CGMCC 17305的生长特性分析

2.4 本章小结

第3章 枯草芽孢杆菌的安全性和益生性

3.1 材料和试剂

3.1.1 试剂和仪器

3.1.2 培养基

3.2 试验方法

3.2.1 黏附性试验

3.2.2 耐酸及耐胆盐试验

3.2.3 胞外水解酶活性测试

3.2.4 抗生素抗性试验

3.3 结果与分析

3.3.1 黏附性

3.3.2 耐酸及耐胆盐特性

3.3.3 胞外水解酶特性

3.3.4 抗生素敏感性

3.4 本章小结

第4章 枯草芽孢杆菌CGMCC 17305水产养殖效果评价

4.1 枯草芽孢杆菌CGMCC 17305养殖实验

4.1.1 罗非鱼养殖方式

4.1.2 南美白对虾养殖方式

4.1.3 药物残留检测

4.1.4 养殖效果评价标准

4.2 结果与分析

4.2.1 枯草芽孢杆菌CGMCC 17305对罗非鱼生长性能影响

4.2.2 枯草芽孢杆菌CGMCC 17305对南美白对虾生长下性能的影响

4.2.3 益生养殖鱼虾产品的安全性评价

4.3 本章小结

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录Ⅰ 淡水虾添加组药物残留检测报告

附录Ⅱ 淡水虾对照组药物残留检测报告

附录Ⅲ 罗非鱼添加组药物残留检测报告

附录Ⅳ 罗非鱼对照组药物残留检测报告

致谢

攻读学位期间的研究成果