抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达及初步纯化

摘要

抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽，是先天免疫的重要防御物质，具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性，且不易产生抗药性，有良好的应用前景。
　　 本文研究的主要内容包括：一是以pleurocidin成熟肽N端23-30位氨基酸和misgurin成熟肽N端7-21位氨基酸杂合成的23肽为基础，选用大肠杆菌偏好密码子，人工设计并合成了PekⅡ杂合肽基因，并将该基因5’端与硫氧还蛋白基因3’端融合，通过pGEX-4T-2表达载体获得较高可溶性表达，SDS-PAGE显示29kD处有特异性的蛋白条带出现，纯化得到的GST-PekⅡ经MALDI-TOF MS分析得出其相对分子质量为29553.03。由于硫氧还蛋白和抗菌肽之间设计了肠激酶（Enterokinase）切割位点，通过对表达的融合蛋白的切割，可得到目标抗菌肽PekⅡ。二是通过对融合蛋白GST-PekⅡ表达条件的优化，结果表明：在37℃条件下，IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L、菌体密度0.8左右、诱导4h能使融合蛋白GST-PekⅡ获得高效表达；三是通过Western免疫印迹试验表明，重组子及阴性对照表达的GST蛋白都可以特异性地和anti-GST抗体识别，重组子菌株表达的融合蛋白比阴性对照略大，未用IPIG诱导的重组子则没有条带出现，充分表明融合蛋白在大肠杆菌中成功表达。四是通过Glutathione SepharoseTM4亲和层析对表达的融合蛋白GST-PekⅡ进行初步纯化并且进行抗菌活性检测，结果表明融合蛋白GST-PekⅡ有较明显的抑制E．coliDH5α生长的作用。
　　 本研究的目的：初步解决了抗菌肽PekⅡ在大肠杆菌中可溶性表达的问题并为进一步开展抗菌肽PekⅡ的酶切、再纯化和活性研究以及大量生产PekⅡ基因奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1文献综述

2引言

3实验材料与方法

3.1材料与试剂

3.1.1菌种、质粒及其来源

3.1.2试剂

3.1.3主要仪器

3.1.4培养基

3.2实验方法

3.2.1重组质粒的构建

3.2.2 CaCl2法制备大肠杆菌BL21和DH5α感受态

3.2.3不同诱导浓度对融合蛋白表达量的影响

3.2.4不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响

3.2.5抗菌肽Pek Ⅱ基因在表达载体pGEX-4T-2中小量表达及表达产物的分析

3.2.6 Western-blotting检测融合蛋白

3.2.7融合蛋白GST-Pek Ⅱ的初步纯化

3.2.8融合蛋白GST-Pek Ⅱ含量的测定

3.2.9 Thrombin对重组蛋白的切割

3.3液体抑菌试验

4.结果与分析

4.1抗菌肽PekⅡ基因的设计、合成和测序

4.2不同诱导浓度对融合蛋白表达量的影响

4.3不同诱导时间对融合蛋白表达量的影响

4.4重组pGEX-Pek Ⅱ的阳性克隆转化受体菌、发酵和小量表达产物分析

4.5 Western-blotting检测融合蛋白

4.6融合蛋白GST-Pek Ⅱ的初步纯化

4.7质谱检测

4.7.1融合蛋白GST-Pek Ⅱ的质谱检测

4.7.2酶切后抗菌肽Pek Ⅱ的质谱检测

4.8融合蛋白GST-Pek Ⅱ含量的测定

4.9融合蛋白GST-Pek Ⅱ的抑菌活性

5讨论

5.1关于抗菌肽Pek Ⅱ基因的设计

5.2关于Westem-blotting检测融合蛋白

5.3关于抗菌肽Pek Ⅱ基因的融合表达和初步纯化

5.4 关于融合蛋白GST-Pek Ⅱ的抑菌活性检测

5.5本研究的意义

6 结论

6.1设计、合成抗菌肽Pek Ⅱ基因

6.2小量诱导表达

6.3 Western-blotting检测融合蛋白

6.4 融合蛋白GST-Pek Ⅱ初步纯化

6.5融合蛋白GST-Pek Ⅱ含量测定

6.6质谱检测抗菌肽Pek Ⅱ

7展望

参考文献

致谢

附录

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