改造枯草芽孢杆菌代谢通路合成透明质酸研究

目录

声明

第一章 前言

1.1 透明质酸的合成

1.2 细菌合成透明质酸的代谢过程

1.3 UDP-GlcNAc的生物合成途径

1.4 UDP-GlcUA的生物合成途径

1.5 透明质酸合成酶

1.6 人工构建透明质酸代谢通路的研究

1.7 调控合成透明质酸分子量的研究

1.8 核开关与基因表达调控

1.9 CRISPR/Cas9系统

第二章 材料和方法

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验菌种和质粒

2.1.4 培养基及溶液配制方法

2.1.5 生物信息分析软件及网站

2.2 实验方法

2.2.1 基因组DNA提取

2.2.2 质粒DNA提取

2.2.3 PCR反应

2.2.4 限制性内切酶酶切

2.2.5 PCR扩增后体系或者酶切后体系纯化回收

2.2.6 连接反应

2.2.7 转化到大肠杆菌感受态细胞

2.2.8 制备并转化枯草感受态细胞

2.2.9 引物设计

2.2.10 重组菌株的鉴定

2.2.11 蓝白斑筛选

2.2.12 一步法快速克隆连接反应

第三章 实验结果

3.1 含有CRISPR/Cas9系统底盘细胞的构建

3.1.1 设计引物

3.1.2 转化含有Cas9的质粒

3.1.3 构建pAW014-3g质粒

3.1.4 转化pAW014-3g质粒

3.2 构建重组质粒

3.2.1 引物设计

3.2.2 PCR扩增

3.2.3 重组质粒的构建

3.3 构建3个操纵子

3.3.1 扩增ugtP、amyE、wprA基因上下游同源臂

3.3.2 扩增目的基因

3.3.3 构建重组质粒

3.4 转化和修复

3.4.1 转化进枯草杆菌中

3.4.2 质粒的消除

3.5 HA的含量和分子量的测定

第四章 结论

参考文献

附录

致谢