安徽白山羊精液冷冻保存技术研究

摘要

安徽白山羊是我省地方山羊品种，属于黄淮山羊的地方类群，具有繁殖力高，适应性强，板质质量优良等特点。用其优秀公羊精液进行冷冻保存应用可以加速该品种保种速度。本实验的目的是研究出适合安徽白山羊精液冷冻保存的稀释液配方和冷冻程序，为安徽白山羊冷冻精液的实际应用奠定基础。
　　 1．选取影响精液冷冻-解冻程序效果的四个因素作为研究对象：稀释比例、平衡时间、解冻液种类和解冻温度。每个因素选取3个水平（种类）：A稀释比例（原精液：稀释液）：1：2(A1)、1：3(A2)和1：4(A3)；B平衡时间：2h(B1)、3h(B2)和4h(B3)；C解冻液种类：葡3-3液(C1)，维生素B12(C2)、2.9％柠檬酸钠(C3)；D解冻温度：40℃(D1)、50℃(D2)、60℃(D3)，以活率、生存指数、顶体完整率和膜完整性作为评判标准，进行L9(34)正交试验，筛选出最佳的精液冷冻-解冻程序。经极差分析结果显示：1）三种稀释比例间各评判标准的极差分析值差异均不显著(P＞0.05)，但A3的极差值均大于其他两组；2）B2精液活率优于B3(P＜0.05)，顶体完整率优于B1(P＜0.05)，膜完整率比B3差(P＜0.05)；3)C1活率优于C2(P＜0.05)，膜完整性优于C2、C3(P＜0.05)，顶体完整率优于C3(P＜0.05)；4)D1活率优于其他D2、D3(P＜0.05)，膜完整率和顶体完整率各组差异不显著。
　　 综上结果表明，最优的冷冻-解冻程序是A3B2C1D1，即1：4稀释，在4℃冰箱平衡3h，以B12作为解冻液，解冻温度为40℃。
　　 2．对缓冲剂进行三步筛选。
　　 初步筛选，挑选四种缓冲剂：柠檬酸钠(E)、Tris(F)、pipes(G)、hepes(H)，分别设计3个水平(E：0.2％、1.6％、3.0％；F：0.02％、2.42％、4.36％：G：0.1％、0.5％、1.0％；H：0.1％、0.5％、1.0％)，进行L9(34)的正交试验，以解冻后精液的直观活率检测结果为参数进行正交设计极差分析，筛选出最佳的缓冲剂组合：E1F2G2H2。
　　 再次筛选，依据初步筛选结果，再细分四种缓冲剂的添加量，即E：0.1g％、0.2％、0.3％；F：1.8％、2.4％、3.0％；G：0.2％、0.5％、0.8％：H：0.2％、0.5％、0.8％，以精液品质综合指数作为正交设计的评判参数进行分析，结果显示各因素影响显著性顺序是E＞H＞G＞F，其中E（柠檬酸钠）和H（hepes）对精液综合指数影响显著(P＜0.05)。
　　 最终筛选，剔除再次筛选中差异不显著的F(Tris)和G(pipes)，重新设计E（柠檬酸钠）和H(hepes)的两因素三水平的正交试验(E：0.2g％、1.6％、3.0％：H：0.2％、0.8％、1.6％)。结果显示1.6％的E和1.6％的H组合添加效果最好(P＜0.05)．
　　 3．在稀释液中添加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和甘油不同组合的冷冻保护剂，研究其对安徽白山羊精液冷冻效果的影响。结果表明，单一的DMF冷冻效果差（P＜0.05），以甘油5％和DMF1％的组合抗冻剂效果最佳，效果优于其他组和单一的甘油使用（P＜0.05）。
　　 4,在冷冻精液稀释液中添加十二烷基磺酸钠(SDS)：0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％．结果发现，当十二烷基磺酸钠添加量为0.1％时，解冻后精子活率达到65.9％，显著高于其他实验组（P＜0.05），精膜完整率达到54.13％，显著高于其他实验组(P＜0.05)：十二烷基磺酸钠添加量为0.2％时，精子顶体完整率最高，达58.46％，但与0.1％添加量相比，差异不显著。综合表明，0.1％的SDS添加组最优。
　　 5．为了进一步检验新配方制作的冻精的冷冻保存效果，对55只同期发情安徽白山羊进行了人工授精试验，在30天42只母羊不返情，计为妊娠，受胎率为76.4％。
　　 综上所述，本实验通过筛选安徽白山羊精液冷冻-解冻程序和缓冲剂组合，添加DMF和SDS，取得了较好的冷冻效果，使安徽白山羊颗粒冷冻精液解冻后的活率提高到0.65，受胎率达到了76.4％。