柞蚕细胞色素P450基因CYP4G25序列的克隆与表达分析

摘要

细胞色素P450单加氧酶系(cytochrome P450 monooxygenases，P450s)为广泛分布于生物有机体内的重要酶系。细胞色素P450基因起源于35亿年前的一个共同祖先，是最古老和最庞大的超基因家族之一。细胞色素P450参与许多重要的生命过程，对动物、植物、真菌和细菌等的研究表明许多不同催化反应都有细胞色素P450的参与。对于昆虫而言，细胞色素P450在昆虫的生命活动中起着十分重要的作用：主要涉及生长、发育、取食等过程，其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性，它还参与了昆虫体内保幼激素、蜕皮激素和脂肪酸等内源化合物的合成与代谢，具有重要的生物学和遗传学意义。
　　 柞蚕是一种正在开发的野生绢丝昆虫，属于鳞翅目、大蚕蛾科、柞蚕属的泌丝昆虫。除了作为纺织工业原料利用外，还有很高的药用和食用等经济价值。利用分子生物学和生物信息学方法对柞蚕P450基因进行研究，获得的主要结果如下：
　　 1．CYP4G25基因的克隆及序列分析：
　　 采用RT-PCR和RACE-PCR方法克隆获得了1个P450新基因CYP4G25的全长序列。CYP4G25全长2112bp，GenBank登录号为GU205081，包括由111个核苷酸组成的5’端非编码区(5’UTR)、由1674个核苷酸组成的ORF(开放阅读框)编码557个氨基酸，分子量大小为63.6KD和等电点为8.6，以及由326个核苷酸组成的3’端非编码区(3’UTR)。通过生物在线网站Expasy分析氨基酸序列：含有血红素结合位点，螺旋I、螺旋K、螺旋C以及N 端含有由22个疏水氨基酸组成的跨膜锚定区域。构建系统进化树分析得到柞蚕和天蚕亲缘关系最近。
　　 2.CYP4G25基因的表达分析：
　　 提取柞蚕不同时期和不同组织的总RNA，以M-MLV反转录第一链cDNA，以柞蚕Actin基因做内参，进行了半定量RT-PCR。实验结果显示，选取的组织基本都有表达，在脂肪体、表皮。中肠、血液、丝腺、触角、精巢和卵巢，且表达量无明显差异。
　　 RT-PCR法扩增了柞蚕细胞色素CYP4G25的ORF，并连接至pET-28a(+)表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，用IPTG进行了不同浓度的诱导表达，经SDS-PAGE电泳和Western blot检测，表明被诱导的目的蛋白均得到了稳定的表达，这为以后对细胞色素CYP4G25的真核表达及其功能的进一步研究奠定基础。

目录

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英文文摘

声明

1 文献综述

2 引言

3 材料与方法

4 结果与分析

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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