玉米全基因组NBS类抗病基因的进化及病原菌诱导表达模式分析

摘要

植物抗病基因的进化、克隆及其病原菌诱导表达模式分析是微生物与植物相互作用研究的重要内容。具有核苷酸结合位点（NBS）结构的基因，是植物中普遍存在的抗病基因，在植物抵抗各种病原物的袭击中发挥重要作用。因此，开展玉米NBS类抗病基因的研究具有重要的理论意义和应用价值。本研究利用生物信息学的方法对玉米全基因组NBS 类基因家族的基因数量、结构特征、染色体定位、基因复制及其进化关系进行分析，研究了EST数据库表达谱以及小斑病、矮花叶病菌诱导NBS类基因的表达模式，在此基础上进行基因克隆，获得如下主要结果：
　　 1、在玉米基因组中，共发现了107个具有NBS结构域的基因，并且根据其N-端和LRR区域分为四大类，即NBS(N)7个，NBS-LRR(NL)31个，CC-NBS (CN)11个和CC-NBS-LRR (CNL)58个。这107个NBS基因被分别定位在玉米10条染色体上，每条染色体上的NBS基因分布数量各有差异，部分呈基因簇的形式存在，并且在第10条染色体上最多，有28个基因存在。
　　 2、对玉米107个基因的基序进行分析，并从上述四类NBS基因中分别发现了15种基序。4个NBS区域的保守基序P-loop、Kinase2、GLPL和MHD在NL和CNL类NBS基因中都有出现，而在N和CN类NBS基因中不规律出现。不同类型的NBS基因间保守基序的序列差异性较小，其中Kinase2基序最为保守，在玉米每一类NBS基因中都有发现。此外，对这107个基因的亲缘进化关系的研究表明，同一类型的NBS基因并没有明显的成簇现象，而是四种类型交错出现在进化树分枝上。
　　 3、将玉米NBS基因与单子叶植物水稻、高粱，双子叶植物拟南芥、百脉根进行比较发现，在数量上，玉米NBS类基因最少，并且与双子叶植物拟南芥和百脉根相比，玉米NBS类基因缺少TIR基序，与单子叶植物水稻、高粱类似。在染色体定位上,玉米NBS基因与拟南芥、水稻、百脉根相似，呈不均衡分布，而高梁呈染色体末端分布。
　　 在基因复制上,玉米NBS类基因的基因复制数量少于拟南芥，远少于水稻，其多基因所占的比例玉米（38.3％）低于拟南芥（46.6％）和水稻（53.7％）；基因簇的数量玉米（22）少于拟南芥（39）和水稻（104）。此外，将玉米的NBS基因分别与拟南芥、百脉根和高粱基因组中的NBS基因共同构建进化树，发现玉米NBS基因与高粱的亲缘关系最近，与百脉根的相对较远，与拟南芥的最远。
　　 4、将已知功能的9个不同植物的NBS基因以及一个玉米抗病基因相似序列与玉米NBS类基因相结合进行亲缘关系分析。结果表明，ZmNBS3与玉米中的抗锈病（Pucciniasorghi）基因Rp1有很高的同源性；ZmNBS42与玉米抗病基因同源相似序列RGA4同源性较高；ZmNBS55与高粱中已知的抗根腐病（Periconia circinata）
　　 基因Pc以及ZmNBS56与大麦中已知抗叶锈病（Puccinia triiticina）基因Lr10也有着非常近的亲缘关系。这为玉米NBS类抗病功能基因克隆提供了初步依据。
　　 5、经小斑病菌、矮花叶病毒和水杨酸胁迫诱导,NBS类基因的表达呈现出不同的表达水平和表达模式，分析的58个基因有47个基因表现出了转录活性。在小斑病菌和水杨酸诱导表达模式中，小斑病菌诱导后约73％的NBS基因表达上调,其中ZmNBS7，34，49，62，69，74，85，86，91，102和103在两种诱导中均表达上调,而ZmNBS56,55，51，48，42和27只表现小斑病病原菌诱导上调。在矮花叶病毒诱导中，ZmNBS39，49，56，61，62，65，74，77，91和103呈现诱导表达上调，且ZmNBS39,56,61,62,91上调敏感性较强。ZmNBS49,56,62,74,91在两种病原菌诱导中均表达上调，ZmNBS42，55和ZmNBS39，77分别表现出对小斑病菌诱导和对矮花叶病毒诱导的特异性上调。
　　 利用玉米EST文库对107个NBS基因分析,得到77个NBS基因在不同组织：芽、根、穗丝、穗、胚乳以及混合组织中的多样表达模式，发现在病原物诱导中，在叶片中未检测到表达的11个基因中的ZmNBS25,52,79和99在不同组织EST库中均未检测到,其它在非叶子组织中表达。
　　 6、综合玉米NBS基因与作物已知功能NBS基因亲缘关系分析和小斑病、矮花叶病菌及水杨酸诱导表达分析，ZmNBS3,ZmNBS42,ZmNBS55,ZmNBS56,ZmNBS39和ZmNBS77可作为重要的抗病候选基因，选择ZmNBS56作为候选基因，从自交系B73中克隆了ZmNBS56B基因，该基因DNA序列全长为1494bp，编码497个氨酸，蛋白结构预测显示该基因编码蛋白为疏水蛋白，且有跨膜结构域。该基因的抗病功能有待进一步验证。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章 文献综述

第二章 玉米全基因组NBS 类基因的进化分析

第三章 玉米与其它植物NBS 类抗病基因比较与进化分析

第四章 玉米NBS 类抗病基因病原菌诱导表达模式分析

第五章 玉米ZmNBS56 基因的克隆

结 论

参考文献

附 录

致 谢

作者简介

攻读博士学位期间发表的论文