茶树咖啡碱生物合成途径研究及其分子调控

摘要

咖啡碱(1，3，7-三甲基黄嘌呤)是存在于植物中的天然生物碱，也是茶叶中嘌呤碱的主体成份，对人体具有兴奋神经、助消化、利尿等生理作用。
　　 咖啡碱作为一种重要的食品添加剂和药用原料，目前主要来源于化学合成，附产物多且污染环境。来源于茶叶或咖啡中天然提取的咖啡碱，则存在原料和加工成木高，易产生有害物残留等弊端。咖啡碱作为茶叶和咖啡等软饮料中的特征成分之一，与部分特殊人群(如幼龄儿童、孕妇、某些疾病患者等)的消费需求存在矛盾，低咖啡碱茶叶产品市场需求旺盛。
　　 因此，采用生物技术手段，通过微生物发酵生产咖啡碱应用潜力较大；研究对茶树咖啡碱合成酶基因的定点突变，实现对咖啡碱生物合成的分子调控，可以为低咖啡碱茶树分子育种提供理论依据。
　　 咖啡碱的合成代谢路径主要分为四步反应，包括三次由甲基转移酶催化进行的甲基化反应和一次由核糖核苷水解酶催化进行的脱核糖反应，具体合成路径为：黄嘌呤核苷(XR)→7-甲基黄嘌呤核苷(7mXR)→7-甲基黄嘌呤(7-MX)→可可碱(3，7-二甲基黄嘌呤)→咖啡碱(Cf)。
　　 本文通过对参与咖啡碱生物合成的相关酶基因在大肠杆菌和酿酒酵母中进行表达、酶活分析，对茶树咖啡碱合成酶基因进行定点突变等，尝试建立通过酵母发酵体外合成咖啡碱的研究平台，探索茶树咖啡碱生物合成的分子调控机制。论文取得以下结果：
　　 1.由咖啡叶中克隆得到了咖啡黄嘌呤核苷甲基转移酶(CaXMT1)，经HPLC和LC-MS检测，结果验证了该酶具有同时催化第一步黄嘌呤核苷甲基化和第二步7-甲基黄嘌呤核苷水解反应的作用，即可以催化底物XR生成7-MX。
　　 2.由茶树叶中克隆得到了咖啡碱合成酶(TCS1)，并验证了该酶具有催化最后两步甲基化反应的作用，即可以催化底物7-MX生成可可碱和咖啡碱。
　　 3.将CaXMT1和TCS1导入酵母细胞中进行组合表达，喂养底物，经发酵后，在产物中检测到咖啡碱，产量为0.38mg/L。
　　 4.从本实验室业已测序的茶树基因组序列中，筛选腺苷核苷酶、肌苷/鸟苷核苷酶、肌苷/鸟苷磷脂酶基因序列，通过在叶和根中半定量RT-PCR特异性扩增，最终筛选到三个候选的茶树7-甲基黄嘌呤核糖核苷水解酶的序列，但尚未检测到酶的活性。
　　 5.分别对茶树咖啡碱合成酶TCS1基因的四个位点进行定点突变(225Arg→His，317Val→Met，271Phe→Trp，272A1a→Pro)，并对突变前后的基因表达产物进行活性分析，发现前两种突变体催化合成可可碱的活性变化明显。
　　 6.将CaXMT1和TCS1导入大肠杆菌细胞中进行组合表达，产物中只有7-甲基黄嘌呤(7-MX)，没有咖啡碱的生成。
　　 研究结果提示，通过在酵母中整合表达CaXMT1和TCS1，可以进行体外发酵生产咖啡碱，但是产量偏低。论文试图通过找到茶树7-甲基黄嘌呤核糖核苷水解酶，来调控7-MX的产量，从而调控咖啡碱的生物合成；或是通过大肠杆菌整合表达，提高咖啡碱产量，但均未得到预期结果。TCS1的突变体产物催化生成可可碱的能力发生了较大变化。以上结果为在酵母表达系统上，实现咖啡碱生物合成的分子调控奠定了基础。