鸳鸯鸭恒定链基因的克隆、分子特征及其组织表达特性

摘要

恒定链(Invariant chain，Ii)分子作为MHCⅡ分子的伴侣分子在内质网中促进了MHCⅡ分子正确折叠、九聚体化及靶向内体的转运，在酸性内体中外源性表位与CLIP序列交换并结合到MHCⅡ分子沟槽，进而抗原被呈递到细胞表面。Ii对MHCⅡ分子的靶向机理已被应用到基于Ii的基因疫苗设计，取得了较好免疫效果，为基因疫苗设计开拓了新思路。除此，Ii还作为多种活性分子的受体参与多种生理过程，因此也成为多种疾病治疗的新靶点。但有关Ii的研究主要集中在人类和小鼠，对于禽类Ii结构与功能研究尚处起步阶段，而禽类生产却面临越来越多的病原挑战，禽类疾病防治也需探索新方法。为此我们以鸳鸯鸭(Moscovy duck，Cairina moschata)为研究对象，对其恒定链及其异构体进行基因克隆、生物信息学分析和结构建模，为深入研究禽类恒定链结构功能、进化趋势与应用等积累理论基础，同时对恒定链在鸳鸯鸭不同组织中的定量表达和定位表达特征进行研究，初步探讨了Ii表达与不同组织器官结构、功能之间的关系。
　　 首先，利用RACE等技术成功获得了1188bp的鸳鸯鸭恒定链(MDIi-1，Genebankno.HQ909102)和1377bp的恒定链异构体(MDIi-2)cDNA序列，其中MDIi-2含有189bp插入序列Tg区，从而证明鸳鸯鸭存在两种恒定链异构体形式。生物信息学分析表明MDIi-1编码222个氨基酸，MDIi-1在核苷酸水平、氨基酸水平及空间结构等方面高度保守，与其他物种Ii比对有相同的功能区，在进化上与其他鸟类Ii高度同源。在不同物种Ii各保守功能区中，CLIP区虽然保持着不低于50％的保守性，但不同物种CLIP区也呈现明显的可变性，这可能是系统进化中环境压力下的适应性选择的结果。MDIi-2编码285个氨基酸，其Tg区高度保守，蛋白质高级结构与其他物种Tg区高度相似。但MDIi-2不是Ii的主要表达形式。
　　 第二，以β-actin基因为内参基因，在十二种组织中分别对MDIi-1和MDIi-2进行实时相对定量PCR。结果表明MDIi-1和MDIi-2两种异构体在同一组织中相伴表达，但MDIi-1是主要表达形式，而且表达水平显著高于MDIi-2。MDIi-1和MDIi-2在被检的十二种器官或组织中分别呈现明显差异表达。脾、胸腺、法氏囊等经典免疫器官呈现MDIi-1的高水平表达，可能与担负机体主要免疫功能有关，但机体成年后胸腺和法氏囊MDIi-1表达水平可能随年龄增长而降低。小肠、肝脏、肾脏等器官也呈现MDIi-1的较高水平表达，其中在小肠粘膜表达水平仅次于脾脏表达，MDIi-1在这些非传统免疫器官可能担负重要局部免疫功能。恒定链在不同组织均有表达暗示其对各种组织都是需要的，只是表达量高低与不同组织先天性结构及所承担的主要功能相关。恒定链不同异构体形式在不同组织细胞中呈现基本一致的差异表达还暗示不同组织细胞存在保守的异构体差异表达调节机制。
　　 第三，原核表达MDIi-1，以表达蛋白免疫小鼠制备抗MDIi-1的抗血清。应用冷冻组织切片技术制备鸳鸯鸭消化管各段、肝脏、脾、胸腺、法氏囊、肺、肾、骨骼肌、心肌等组织切片，以抗MDIi-1血清为一抗、Dylight488标记的兔抗鼠IgG为二抗对MDIi-1在多个器官组织中的分布规律进行了荧光免疫组化定位检测。显示消化管各段粘膜层存在MDli的高表达巨噬细胞、树突细胞等，MDIi在粘膜上皮和固有层腺体上皮细胞呈弱表达且极性分布；肝细胞不表达MDIi，肝板之间存在个体较大的疑似Kupffer细胞、树突细胞等强表达细胞；胸腺组织中T细胞不表达MDIi，由皮质部向髓质部逐渐增多的网状上皮细胞和交错突细胞等呈现MDIi的强表达；脾组织充满大量强表达MDIi的B细胞；MDIi主要在法氏囊粘膜层表达，其中上皮细胞弱表达且极性分布，固有层淋巴滤泡含有大量高表达MDIi的B细胞，B细胞分布由皮质向髓质逐渐增多、表达增强；肺组织各级支气管上皮细胞不表达MDIi，上皮下结缔组织存少量散在强表达MDIi的疑似巨噬细胞；肾实质的间质中散布MDIi表达细胞，血管球和肾小管上皮不表达MDIi；骨骼肌和心肌组织只在肌纤维间结缔组织存在很少量MDIi表达细胞。
　　 最后，用抗鸡Ii血清和抗鸳鸯鸭Ii血清分别和异种禽类Ii之间存在交叉免疫反应的免疫学方法证明了物种间Ii结构的高度保守性。