茶树中与氨基酸合成相关的三个基因的克隆与分析

摘要

在构建茶树幼根cDNA文库获得相关EST序列的基础上，通过SMARTRACEPCR技术获得了茶树中谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS1-1、GS1-2)及精氨酸脱羧酶(Argininedecarboxylase，ADC)基因的cDNA全长序列。
　　 GS1-1基因的3’端序列与已知的EST序列拼接后得到大小为2906bp的cDNA序列，其开放阅读框(ORF)全长为2532bp，共编码843个氨基酸，分子量为93.553kDa，理论等电点(pI)为6.258。该蛋白质的a螺旋结构是41.52％，B螺旋结构是10.79％，无规则卷曲及其它结构为47.69％，其中无规则卷曲是整个蛋白的主要结构元件，a螺旋其次，β折叠最少。GS1-1蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白，跨膜方向是由内向外，无信号肽序列存在，共有31个可能的磷酸化位点，是细胞核蛋白。基因分子进化分析表明其与葡萄的亲缘关系较近。
　　 GS1-2基因的cDNA全长序列共1710bp，ORF全长为1071bp，共编码356个氨基酸，蛋白质的分子量为39.34kDa，理论等电点(pI)为5.65。GS1-2蛋白二级结构中，α螺旋结构占26.29％，β折叠结构占23.03％，无规则卷曲及其它结构为50.28％，其中无规则卷曲是GS1-2蛋白质的整体结构中的主要结构元件，α螺旋和β折叠散布于整个蛋白质中。GS1-2蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白，不跨膜运动，无信号肽序列存在，共有27个可能的磷酸化位点，存在于过氧化物酶体。基因分子进化分析表明其与葡萄的亲缘关系较近。
　　 ADC基因cDNA全长为2988bp，开放阅读框(ORF)全长为2163bp，共编码720个氨基酸，编码的蛋白质的分子量为77.430kDa，理论等电点(pI)为5.373，其序列中不存在卷曲螺旋结构。ADC蛋白为亲水性非分泌不稳定蛋白，不跨膜运动，无信号肽序列存在，共有41个可能的磷酸化位点，存在于叶绿体基质中，是细胞质蛋白。基因分子进化分析表明其与碧桃和苹果的ADC亲缘关系较近。
　　 成功构建了以pET32a为载体及。Rosetta为宿主菌的原核表达体系，经1mM浓度的IPTG，37℃，4h诱导后得到了分子量大小为39.5kDa的蛋白，与预测的GS1-2蛋白39.34kDa大小相符。通过凝胶成像分析系统定量分析可知，重组蛋白约占菌体总蛋白的47.1％。
　　 GS1-1、GS1-2及ADC基因cDNA全长序列的获得及GS1-2基因的初步原核表达，对于进一步研究GS和ADC在茶树氮代谢及茶氨酸代谢途径中的作用提供了基础。