茶树中三个与茶尺蠖取食诱导相关的肉桂醇脱氢酶(CAD)基因克隆与功能分析

摘要

木质素是由多种简单的苯丙烷及其衍生物聚合形成的复杂聚合物，其通过有效物理化学屏障在植物抵抗病、虫害侵入中起着重要作用。而肉桂醇脱氢酶(CAD)是控制木质素生物合成途径的关键酶之一，然而茶树体内 CAD基因相关研究及其与抗虫性之间的关系研究至今未见报道。本论文主要对茶树叶片中的三个与茶尺蠖取食诱导相关的 CAD基因进行了 cDNA克隆，鉴定和表达特征分析。主要结果如下：
　　 1．基于本课题组建立的茶树被茶尺蠖取食诱导前后的 cDNA消减杂交文库（SSH）和茶树全器官转录组库获得的 3 条与 CAD基因同源性很高的 EST序列，利用 RACE 技术分别克隆了编码 CAD基因的全长 cDNA序列，其中 1条来自于SSH 编码的CAD 命名为CAD2，2 条来自于转录组库编码的CAD分别命名为CAD1和CAD3。CAD2基因全长为 1574bp，开放阅读框972bp，编码 324个氨基酸；CAD1基因全长为 1386bp，开放阅读框 1146bp，编码 382个氨基酸； CAD3 全长为1350bp，开放阅读框1083bp，编码361个氨基酸。
　　 并将三个基因的序列递交到 GenBank，登录号分别为 HM440158、HQ880207和HQ880208。
　　 2．多序列同源比对和蛋白质结构预测分析表明，CAD1和 CAD3 之间同源性为54％，而两者与CAD2 同源性比较低，仅为20％。只有CAD1和CAD3含有二者共有的3个保守的功能结构域：Zn1 结合位点[GHE(X)2(X)5G(X)2V]，Zn2 结合位点 [GD(X)9.10C(X)2C(X)2C(X)7C]和 NADPH 辅酶结合位点[GXG(X)2G]；仅 CAD2 含有依赖于 NADPH的表异构酶/脱水酶家族的氧化还原酶功能结构域。进化树分析结果表明，CAD1、CAD2和 CAD3分属于 3个不同的家族。
　　 3．原核表达结果表明，CAD2基因表达的蛋白大部分是分布于上清的可溶性蛋白，分子量为53 kD，而 CAD1和CAD3基因表达的蛋白皆形成包涵体，分子量分别为59 kD与56 kD。酶活测定结果发现，三个CAD基因表达的蛋白质具有不同的催化活性，其中以CAD2 活性最高，为0.43μmol·min 1·mg 1，CAD3 次之，为4.2nmol·min 1·mg 1，CAD1 最小，为3.8nmol·min 1·mg 1。CAD2的最适pH 为6，最适温度为30℃，酶动力学参数Km 为1.974μmol·L 1，Vmax 为1.7437μmol·min 1·mg 1。
　　 4．利用Southern blot 技术分析发现，茶树基因组中的CAD1和CAD2基因均以双拷贝存在，而CAD3基因则是以单拷贝形式存在。
　　 5．茶尺蠖取食诱导3个CAD基因的表达量不尽相同，其中CAD1和CAD2间的诱导表达量的最大值差异不大，但是二者各自与CAD3的差别要明显大于CAD1和CAD2 间的差异；三个基因的诱导表达量皆存在品种间差异，总体表现为舒茶早大于龙井43；从诱导表达规律上来说，三个基因也存在差异，CAD1和CAD2表达量均是随着取食后时间增加而缓慢增加，最大值分别出现在24 h和912h之间，而CAD3是先急剧增加至最大值，紧接着急剧下降，最大值则出现在36h 之间。而单独的机械损伤处理后，三个基因间的最大表达量差异与茶尺蠖取食诱导的类似，但是品种间差异不显著。通过外源激素诱导试验发现，茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和脱落酸(ABA)处理均能诱导 3个 CAD基因的表达上调，但是三者各自的最大表达量随着激素种类的不同而存在差异，MeJA和 SA 诱导CAD1和 CAD2基因的最大表达量要明显高于 CAD3，而 ABA 诱导 CAD1与 CAD3基因的最大表达量均明显高于CAD2基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

1 文献综述

2 引言

3 材料与方法

4 结果与分析

5 讨论

6 结论

参考文献

附录 A 英文缩写词汇表

致谢

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