基于茶树基因组信息的SSR分子标记的筛选及其初步应用

摘要

SSR标记具有其他分子标记无可比拟的优越性，但是SSR引物的开发必须预先知道核酸序列信息，因此目前报道的茶树SSR引物均为来源于茶树基因组编码区，即EST-SSR，但是其与基于基因组信息的SSR(gSSR)相比，多态性较低。而有关茶树gSSR分子标记的开发鲜见报道。本研究利用本实验室前期研究获得的茶树基因组序列的初步数据，试图开发一批茶树gSSR引物，并建立茶树gSSR标记技术体系，旨在开发出高质量的茶树gSSR标记，为茶树的遗传多样性分析、构建高质量的茶树遗传图谱、系统分类、亲缘关系分子标记辅助育种等研究提供依据。论文所取得的结果如下：
　　 1.对现有提取茶树基因组DNA提取方法进行了适当改进，获得了可以同时提取多种茶树鲜叶高质量DNA的方法。
　　 2.对茶树SSR-PCR反应体系进行优化，建立适合扩增多个样品和多对引物的扩增反应体系；对变性聚丙烯酰胺凝胶的交联度进行优化表明，聚丙烯酰胺凝胶的交联度为5.0％时，分离条带效果最佳
　　 3.基于茶树基因组序列信息，共设计了228对用于gSSR扩增的引物，结果有86对扩增效果较好，扩增片段大小在150bp-400bp；经过8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后，其中的27对引物扩增的特异性条带具有多态性，能用于SSR多态性分析。
　　 4.利用已开发的27对茶树gSSR引物，对24个包括来自云南的野生古茶树、野生古茶树自然杂交群体和现行的栽培种茶树样品进行遗传多样性分析，结果共检测出95个等位位点和158种基因型；每对引物可检测到的等位位点数和基因型数分别为2-6个和3-11种；平均等位位点数、平均基因型数和PIC值分别为3.52、5.85与0.45；Nei指数的范围在0.05-0.72之间，其平均值为0.51；Shannon信息指数(I)在0.11-1.54内，其平均值为0.91；观测杂合度(Ho)为0.10-0.52，平均为0.2785；期望杂合度(He)为0.05-0.78，平均为0.52；遗传相似系数在0.51-0.85之间。这些结果提示所检测的茶树资源和品种在DNA分子水平存在着丰富的遗传多样性。
　　 5.UPGMA法(非加权组平均法)聚类分析表明，在遗传相似系数为0.58时，现行栽培种与古茶树资源明显分别聚成独立的一类，符合品种演化规律，说明本论文初步开发的27对gSSR引物在用于茶树遗传多样性分析方面具有可靠性。