刀豆组织悬浮培养体系的建立及刀豆氨酸的诱导、分离提取

摘要

刀豆氨酸是一种天然的非蛋白质碱性氨基酸，等电点为8.2，极易溶于水，存在于一些豆类中合成的非蛋白质的碱性L-α-氨基酸，具有一定的毒性、抗肿瘤性和抗代谢性。刀豆氨酸的制备方法主要有两种：一种是化学合成法，一种是生物提取法，后者较前者操作简单。L-刀豆氨酸被认为是一种潜在的生物杀虫剂，由于其为贮氮化合物，可作为一种肥料，另外刀豆氨酸具有低毒性，对自然环境无污染，因此具有很高的研究价值。在国内对从植物组织中提取刀豆氨酸的报道目前较少，陈东芳发现L-刀豆氨酸与2，4-二硝基氟苯在硼砂缓冲液会出现特殊颜色反应。目前L-刀豆氨酸与2，4-二硝基氟苯在硼砂缓冲液中的反应是提取刀豆氨酸最简单、最快速的一种试验方法。通过试验发现在多种氨基酸存在的情况下，这一颜色反应灵敏度不高，初步推测其原因为DNFB与其他氨基酸的结合能力比跟刀豆氨酸结合的能力要强，并且陈东芳未对反应中涉及的试剂进行光谱扫描和复合物稳定性测定。本论文主要以刀豆氨酸的鲜重、刀豆氨酸含量及尿素含量为考察指标，进行了多因素多水平的优化实验，建立悬浮培养体系，并用化学因素和物理因素进行诱导，以便提高提取刀豆氨酸的效率。
　　 研究结果表明：
　　 (1)研究刀豆氨酸的提取及2，4-二硝基氟苯与刀豆氨酸在pH9.5硼砂缓冲溶液中反应的最佳条件，进而优化测定刀豆氨酸的方法。运用分光光度法测定2，4-二硝基氟苯与刀豆氨酸的复合物在571nm处的吸光值。结果表明，刀豆氨酸水提取法效果最好，DNFB-乙腈的用量为30μL时，刀豆氨酸与DNFB反应的复合物在571nm处有最大吸收值。在30min内稳定以后该复合物的OD值随着时间的增长而增加，对应线性回归方程为y=0.0083x-0.052，相关系数R2=0.9986。
　　 (2)组织悬浮培养过程中愈伤组织生长曲线大致呈“S”型，生长周期为18d，分为延迟期、指数期和稳定期。开始细胞适应新环境愈伤组织增重缓慢，在培养的12～18d细胞迅速分裂和生长，第18～21d由于培养基中有害物质的积累以及养分的耗尽细胞增重缓慢。刀豆氨酸含量呈先稍有下降后上升，最后又下降的趋势。
　　 (3)研究了刀豆悬浮培养细胞的生长曲线及在刀豆愈伤组织悬浮培养过程中，添加不同的蔗糖量、6-BA量、NAA量对刀豆悬浮培养细胞的生长及合成刀豆氨酸和尿素含量的影响。结果表明：蔗糖30g/L时最适合细胞生长，组织达到最大值9.02g，蔗糖为20g/L时最有利于刀豆氨酸的合成在第18天时达到最大值；6-BA为4.0mg/L时细胞鲜重和尿素含量在第18天时达到最大值，6-BA为2.0mg/L时悬浮培养液中刀豆氨酸在第18天时达到最大值；NAA浓度为1.0mg/L时最适宜细胞的生长以及刀豆氨酸的生产。
　　 (4)运用两步培养法，根据生长培养基转接到生产培养的时间，得出在第12天转接时，刀豆氨酸含量及尿素含量足最大的。用茉莉酸甲酯和二氢茉莉酮酸甲酯对刀豆悬浮培养组织进行诱导，向刀豆细胞悬浮培养体系中分别添加40μmol/L茉莉酸甲酯和20μmol/L二氢茉莉酮酸甲酯时，细胞中刀豆氨酸产量最高。
　　 (5)运用超声波、光照等因素对刀豆悬浮培养进行培养，结果表明：60Hz时刀豆氨酸含量及尿素含量达到最大值，在60Hz下，第9天对植物组织进行超声产生的刀豆氨酸含量及尿素含量最好：平均光照12小时下的培养基产出刀豆氨酸含量和尿素含量明显多于0小时光照和24小时光照的培养基。
　　 (6)刀豆氨酸水提取法效果最好，提取量最大；本实验采用732阳离子交换树脂为分离方法，以氨水为洗脱剂分离纯化刀豆氨酸，结果表明氨水的最适浓度为3mol/L；茚三酮实验的结论表明阳离子交换树脂可以分离碱性氨基酸。对实验数据分析证明刀豆氨酸是碱性氨基酸，其等电点为8.2。