茶树MEP途径中HDS与HDR基因的cDNA全长克隆、功能分析与表达特征研究

摘要

萜类化合物(Terpenoids)是一类由异戊二烯为基本结构单元构建的化合物,是茶树次生代谢物的重要的组成部分,在茶树间接防御中起到相当重要的作用。而4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS)、4-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)参与萜类物质代谢上游途径之一的MEP途径中最后两步反应,且HDR还是MEP途径的关键限速酶之一,然而茶树体内HDS、HDR基因信息及其相关功能至今未见报道。本论文主要对茶树叶片中的HDS、HDR基因进行了cDNA全长克隆、功能分析及其在不同组织器官与逆境下表达特征的研究。主要结果如下:
　　1.课题组前期构建了茶树被茶尺蠖取食诱导前后的cDNA消减杂交文库(SSH),并分离得到2条分别与HDS、HDR基因同源性很高的EST序列,基于此,利用RACE技术分别获得了各自的全长cDNA序列,分别命名为CsHDS和CsHDR。CsHDS的cDNA全长为2603bp,开放阅读框2226bp,编码741个氨基酸;CsHDR的全长1716bp,开放阅读框1380bp,编码459个氨基酸,并将上述两个基因的序列递交到GenBank,登录号分别为JQ014629与JQ014628。
　　2.生物信息学分析表明,CsHDS含有2个保守的GcpE功能域与3个半胱氨酸残基活性位点;CsHDR包含1个保守的LYTB功能域与4个保守的半胱氨酸残基活性位点;两者均含一段叶绿体转运肽。
　　3.组织特异性表达分析表明,CsHDS在成熟叶中表达量最高,是芽的3.09倍,而CsHDR在成熟叶、花瓣与根中的表达量均很高,是芽的2.24-2.56倍,但是两个基因表达量均在嫩茎中最低,分别是芽的0.62与0.57倍。
　　4.茶树被茶尺蠖取食后,CsHDS与CsHDR的表达量均有显著上调且上调趋势一致,均在茶尺蠖取食后24h表达量上调至最高值,分别为对照的10.31倍与7.13倍,但在取食后48h时,其表达量均降至与对照相当;茶树叶片受机械损伤处理后,二者的表达量皆被诱导上调,但上调幅度明显低于被茶尺蠖取食处理后的诱导表达量;经5倍稀释的茶尺蠖口腔分泌液处理后发现,两个基因的表达量均在处理后6h显著上调,分别为对照的2.01倍与3.46倍。
　　5.经茉莉酸甲酯(MeJA)处理后6h,CsHDS表达量上调到对照的2.31倍,之后降至与对照的表达水平相当,而CsHDR则在处理后6和24h表达量明显高于对照;经水杨酸(SA)处理后12h,CsHDS与CsHDR的表达量均被诱导上调,分别是对照的1.92与1.71倍,在其它时间段内,前者的表达量明显低于对照,而后者与对照没有明显的差异,但是两者各自的最大表达量随着激素种类的不同而存在差异;经ABA处理后,CsHDS在各时间点表达量均显著低于对照,而CsHDR除了处理后6h以外,其它时间点也表现类似规律;经推荐浓度的吡虫啉喷施处理后4d,CsHDS的表达量显著上调,而CsHDR则相反。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

图表清单

1文献综述

1.1 植物与害虫相互作用研究进展

1.2萜类化合物生物合成途径的相关研究进展

1.3 HDS与HDR研究进展

2 引 言

2.1研究意义与目的

2.2 研究内容

2.3 技术路线

3 材料与方法

3.1 试验材料与处理

3.2 主要试剂与配方

3.3方法

4 结果与分析

4.1 CsHDS与CsHDR的全长cDNA克隆与序列分析

4.2 CsHDR真核表达载体的构建

4.3 拟南芥HDR突变体的种植与农杆菌转化烟草

4.3.1 拟南芥HDR突变体的种植

4.3.2 农杆菌转化烟草

4.4 CsHDS与CsHDR的表达特征分析

5 讨论

5.1 CsHDS与CsHDR的结构特征与进化分类

5.2 CsHDS与CsHDR的表达特征分析

5.3 CsHDR的功能验证

6 结论

参考文献

附录 英文缩写词汇表

致谢

作者简介