基于遗传转化手段防治番茄黄化曲叶病毒的研究

摘要

番茄黄化曲叶病(TomatoyellowleafCurlDisease,TYLCD)是由烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafCurlVirus,TYLCV)引起的、严重危害番茄生产的一种双生病毒病。目前防治TYLCV的危害主要策略是防控烟粉虱和选育抗TYLCV番茄品种等措施,因此研究植物抗虫性和抗病性的分子机制对培育抗病性番茄十分重要。本研究利用遗传转化的手段,将烟粉虱参与杀虫剂解毒代谢的细胞色素P450基因CYP6CM1和羧酸酯酶基因Coe1构建RNAi载体转化烟草、番茄抗TYLCV相关基因slIAA4转化番茄,研究通过转基因途径实现抗烟粉虱和抗TYLCV的可能性。
　　烟粉虱的抗药性与其体内解毒酶的解毒代谢作用增强密切相关,细胞色素P450酶系和羧酸酯酶系是烟粉虱体内的重要解毒酶系。根据Q型烟粉虱的一个P450基因(CYP6CM1基因)和一个羧酸酯酶基因(coe1基因)的特异区域构建双价RNAi载体,农杆菌介导法转化烟草,PCR检测获得5株独立的转基因株系;选取卡那霉素抗性较好的T1代转基因株系H1和H2饲喂烟粉虱5d后,荧光定量PCR检测烟粉虱体内CYP6CM1和coe1基因的表达水平,发现取食转基因烟草烟粉虱的CYP6CM1基因和coe1基因表达量仅为取食非转基因烟草烟粉虱的18％-24%和17%-33%。通过琼脂保湿浸叶法和单株活体法进一步研究烟粉虱取食转基因烟草后对杀虫剂的敏感性,发现接触1g·L-1阿维·吡虫啉72h后,取食转基因烟草的烟粉虱死亡率分别比取食非转基因烟草的烟粉虱死亡率显著升高14.77%-16.46%和16.01%-18.51%;同样,接触稀释1000倍的40%(v/v)辛硫磷72h后,烟粉虱死亡率显著升高22.94%-23.58%和17.4%-18.76%。以上结果表明,转CYP6CM1-coe1RNAi基因烟草可以显著抑制取食烟粉虱体内CYP6CM1基因和coe1基因的表达水平,降低烟粉虱对烟碱类杀虫剂阿维·吡虫啉和有机磷类杀虫剂辛硫磷的抗药性,显著提高了杀虫剂防治效果,进而提高对烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒的防治效果。
　　植物与侵染植物的病原微生物互作可改变植物体内生长素的合成,而植物生长素含量的改变会通过系列基因的表达变化调节植株的生理反应和生长发育。本研究对TYLCV胁迫下的含Ty-3抗性基因番茄品种和感病番茄品种9210的转录组学差异进行分析,发现生长素信号传导参与了TYLCV与番茄的互作过程,其中一个属于Aux/IAA生长素原初反应基因家族的slIAA4基因表达差异明显。通过RT-PCR克隆了抗性番茄的slIAA4基因,qRT-PCR检测发现slIAA4基因在番茄的根、茎、叶、花中都有较高水平的表达,并能响应TYLCV的侵染,在烟粉虱接种TYLCV0d、3d、5d、7d时,slIAA4基因表达量逐步升高,7d时提升到8倍。进一步构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导转化感病番茄植株9210,获得35株卡那霉素抗性番茄,选取其中6株进行qRT-PCR检测,5株T0代转基因番茄苗slIAA4基因的表达水平比番茄9210显著上调10-50倍。通过茎杆注射TYLCV侵染性克隆2周后,感病番茄9210和转基因番茄都有明显TYLCV发病症状,但qRT-PCR检测发现转基因番茄体内TYLCV病毒积累量是感病番茄的6-8倍。构建TRV2-slIAA4VIGS载体转化农杆菌,通过农杆菌侵润法注射抗病番茄子叶,20d后发现番茄株型显著矮化且根系不发达,后期生长畸形,qRT-PCR检测发现侵润后的抗病番茄slIAA4基因表达量下降至对照的0.5-0.7倍;进一步通过茎杆注射TYLCV侵染性克隆2周后,qRT-PCR检测发现slIAA4基因沉默的抗病番茄病毒积累量是slIAA4基因未沉默的抗性番茄病毒积累量的20%-40%,病毒复制量减少。综合上述结果,slIAA4基因过量表达导致番茄体内TYLCV含量增加,而slIAA4基因沉默则降低番茄体内TYLCV含量,表明slIAA4基因是番茄黄化曲叶病毒的抗病相关基因。

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英文缩略表

第一部分 文献综述

1 前言

2 番茄黄化曲叶病毒的研究进展

3 传毒烟粉虱的化学防治研究进展

4 Aux/IAA家族蛋白与植物抗病性的关系

5 农杆菌介导植物遗传转化研究进展

6 RNAi发展历程及应用

7 研究目的和意义

第二部分 研究报告

第一章CYP6CM1和coe1 RNAi转基因烟草对传毒烟粉虱的防治研究

第二章 番茄抗番茄黄化曲叶病毒番茄相关基因slIAA4的克隆

全文结论

参考文献

致谢

附录

作者简介

攻读硕士期间发表的学术论文