肝窦状内皮细胞分离纯化和永生化

摘要

第一章小鼠肝脏窦状内皮细胞分离和培养的新方法　　 目的：建立小鼠肝窦状内皮细胞(sinusoidalendothelialcells，SEC)的分离培养方法，研究其生物学特性。　　 方法：中性蛋白酶(dispase)消化小鼠肝组织，Percoll密度梯度离心分离消化后的细胞悬液，用内皮细胞选择培养基及酶差异消化法纯化SEC;免疫细胞化学染色检测SEC的表面标志，电镜分析SEC的超微结构，观察DiI荧光标记的乙酰低密度脂蛋白(Acetylated-LowDensityLipoprotein，DiI-Ac-LDL)摄取能力以及体外成血管能力分析SEC的功能。　　 结果：分离纯化后的细胞呈典型鹅卵石样内皮细胞形态，这些细胞表达内皮细胞特征性标志vWF，但不表达CD31以及间质细胞和上皮细胞的表面标志，具有窦状内皮细胞特征性的窗孔结构，Weibel-Palade小体；能摄取DiI-Ac-LDL，并有一定的成血管能力。　　 结论：建立了一种分离、培养SEC的方法，为研究SEC的功能奠定了基础。　　 第二章小鼠肝窦状内皮细胞自发永生化　　 目的：研究自发永生化肝窦状内皮细胞生物学特性。　　 方法：5-溴-4氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷(X-gal)染色检测衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidaseSA-β-Gal)活性。免疫细胞化学染色和流式细胞术检测永生化SEC的表面标志，细胞生长曲线分析永生化SEC的增殖能力。DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（Acetylated-LowDensityLipoprotein，DiI-Ac-LDL）摄取能力、体外成血管能力分析永生化SEC的功能。染色体核型分析永生化SEC遗传稳定性；软琼脂体外培养、SCID小鼠体内接种观察永生化SEC体内外成瘤性，Westernblot分析永生化SECP53蛋白表达水平的改变。　　 结果：在体外培养8代后，SEC发生衰老。衰老细胞继续培养约40天左右，衰老细胞层上出现新的圆形、折光性强的新生细胞，这些细胞呈克隆性、多层生长，且随传代次数的增加，增殖能力增强，与永生化细胞特性一致。表达内皮细胞特征性标志物vWF和CD31，也表达间质细胞标志CD90、CD105和desmin;能摄取DiI-Ac-LDL，但失去成血管能力；体内外均无成瘤性，P53蛋白表达明显增加。　　 结论：肝窦状内皮细胞在体外培养条件下自发永生化。

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文摘

英文文摘

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技术路线

前言

第一章 小鼠窦状内皮细胞分离方法

1． 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

2 结果

2.1 肝窦状内皮细胞分离

2.2 肝窦状内皮细胞纯化

2.3 SEC免疫表型分析

2.4 SEC功能分析

2.5 SEC膜表面具有典型的窗孔样结构

2.6 SEC内含有W-P小体

3 讨论

4 结论

附图

第二章 永生化窦状内皮细胞的生物学特性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 SEC衰老检测及细胞状态

2.2 永生化SEC免疫表型分析

2.3 永生化SEC功能分析

2.4 永生化SEC膜表面没有窗孔样结构

2.5 永生化SEC染色体数量及普通G显带核型均保持正常

2.6 永生化窦状内皮细胞体内体外均无成瘤作用

2.7 永生化前后窦状内皮细胞P53蛋白表达增加

2.8 细胞生长曲线

3． 讨论

4 结论

附图

总结

参考文献

综述 人胚胎干细胞向造血干细胞分化研究进展

致谢

在读硕士期间成果

个人简历