分子开关检测PTEN基因G389A、968delA突变与子宫内膜癌的相关性研究

摘要

目的：　　探讨突变敏感性分子开关检测基因突变的技术平台在筛查临床上子宫内膜癌患者组织DNA中PTEN基因G389A、968delA两位点突变的应用，并分析两位点突变与子宫内膜癌发生、发展的相关性。　　方法：　　先提取96例正常人血液DNA为模板，设计2对有重叠互补区的引物对PTEN基因的exon5和exon8两片段分别进行扩增，再利用重叠PCR法对这两片段混合连接得到野生型PTEN基因融合片段，将此片段插入pMD19-T载体得到野生型pMD19-exon5-exon8融合重组载体；再以其为模板设计G389A和968delA两突变引物，依据重叠PCR定点突变原理，得到含突变型PTEN基因融合片段，与T载体相连接得到突变型重组质粒。两种质粒用菌液PCR或蓝白筛选进行阳性克隆筛选，DNA测序进行验证。以构建的重组质粒为模板分别设计检测G389A和968delA两位点的野生型特异性引物和突变型特异性引物，并在3’端进行硫化修饰，用高保真酶介导的分子开关技术检测两PTEN融合重组载体，并探索此技术检测的灵敏度和特异性。然后将成功建立的分子开关技术检测基因突变的平台应用于子宫内膜癌患者组织DNA中PTEN基因G389A和968delA两位点突变的筛查。最后统计分析PTEN基因两位点突变与国内子宫内膜癌之间是否有关。　　结果：　　运用菌液PCR和DNA测序验证了利用重叠PCR进行体外两片段延伸和定点突变成功建立的PTEN基因两位点的野生型及突变型质粒模板。成功利用分子开关技术对两质粒模板中PTEN基因的G389A、968delA两位点突变进行了检测，电泳结果显示，当（野生型/突变型）特异性检测引物与质粒模板完全匹配时，凝胶电泳会出现对应条带，即有 PCR产物；反之，不完全匹配时，凝胶电泳则没有条带，即无 PCR产物。并测得分子开关检测突变模板的灵敏度为10-3 ng/μL。　　分子开关对62例子宫内膜癌组织DNA和21例正常子宫内膜组织DNA中的PTEN基因突变进行筛查发现，收集的EC样本中有1例PTEN基因的389位G>A的杂合突变，未检测到968delA的突变，并通过测序得到证实。EC组的GG基因型频率为0.984，GA（AA）基因型频率为0.016，高于正常对照组的GA（AA）基因型频率（P>0.05）。　　结论：　　成功建立分子开关技术检测PTEN基因G389A及968delA两位点突变的技术平台。成功将此技术运用到国内还未见报道的PTEN基因突变筛查中，并通过分析PTEN基因型频率发现，中国人群中子宫内膜癌的发病与PTEN基因G389A及968delA两位点突变可能无关，为国内临床上子宫内膜癌的诊断及治疗提供新的思路。

目录

声明

主要英文缩略语索引

第1章 绪 论

第2章 实 验 材 料

2.1 主要仪器

2.2 主要试剂

第3章 实 验 方 法

3.1 主要溶液的配制

3.2 引物设计

3.3 样本采集

3.4 血液、组织基因组DNA的抽提

3.5 野生型重组质粒模板的构建及鉴定

3.6 突变型重组质粒模板的构建及鉴定

3.7 运用高保真DNA聚合酶介导的分子开关技术，在不同PCR反应体系中分别检测G389A、968delA两突变位点

3.8 运用高保真DNA聚合酶介导的分子开关技术，在同一PCR反应体系中分别检测G389A、968delA两突变位点

3.9 利用突变敏感性分子开关，对组织DNA样本的检测

4.0 统计学分析

第4章 实 验 结 果

4.1 重叠延伸PCR法构建野生型重组质粒及鉴定

4.2 重叠PCR法定点诱变的突变重组质粒的构建及鉴定

4.3 运用分子开关技术平台，在不同PCR反应体系中分别检测G389A、968delA单位点突变

4.4 运用分子开关技术平台，在同一PCR反应体系中检测两位点突变

4.5 运用突变敏感性分子开关技术，对子宫内膜癌患者样本PTEN基因热点突变进行检测及分析

第5章 实 验 讨 论

第6章 实 验 结 论

参考文献

综述:循环游离DNA与肿瘤的研究进展

研究生期间科研成果

致谢