AJV-HF211毒株感染的DF-1细胞中NALP3和MDA5的转录水平

摘要

天然免疫系统通过表达不同的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)特异性地识别入侵的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，发挥级联信号转导作用，从而达到抗病毒免疫防御作用。MDA5和NALP3分别为模式识别受体维甲酸诱导基因I样受体家族（Retinoic acid-inducible gene I-like receptors，RLRs）家族和核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs）亚家族中的重要成员。它们能够识别RNA病毒，并调节细胞因子，发挥非特异抗病毒作用。J亚群禽白血病（Avian leucosis virus subgroup J, ALV-J）是近年来受到广泛关注的禽白血病的一种，感染该病毒的鸡往往会发生免疫抑制，导致机体的免疫应答受阻。本研究为了解鸡模式识别受体NALP3和MDA5在ALV-J感染细胞中的作用，本研究通过在对一株ALV-J野毒株的分离、鉴定及其env基因遗传进化分析的基础上，建立了检测ALV-J病毒感染DF-1细胞诱导NALP3和MDA5的表达的实时荧光定量RT-PCR方法，为进一步探讨NALP3和MDA5受体抗ALV-J感染的免疫通路奠定基础。
　　首先，本实验室从安徽省合肥市某蛋鸡场疑似感染ALV-J的鸡群中分离并鉴定了1株ALV-J。患鸡精神沉郁，明显消瘦，皮肤苍白。经过剖检，发现肝脏、脾脏、卵巢明显肿大，其中肝脏表面有大量白色肿瘤小结节。采用组织研磨、过滤方法，将肝脏病料液接种鸡胚原代成纤维细胞和DF-1细胞系，提取培养7d细胞的总RNA和DNA，利用H5/H7特异性引物和env基因引物进行PCR扩增后，分别获得545bp和2106bp大小的目的条带，将两个片段分别插入pMD-18T载体中，转化于E.coil DH5α大肠杆菌并挑取阳性克隆进行测序。结果表明，本实验室成功分离了一株引发多种组织肿瘤的临床分离毒株，命名为AJV-HF211。通过DNA Man软件对国内外已报道的14株ALV-J进行同源性分析，结果表明，AJV-HF211毒株与这14株同源性为88.8％~94.0%，其中与国内广东分离株GD1109同源性为94.0%，同源性最高，亲缘关系最近。AJV-HF211毒株与英国原毒株HPRS-103的同源性仅为89.3%，不在同一分支，亲缘关系相对较远，表明AJV-HF211在遗传进化过程中存在较大的变异。
　　其次，本研究通过设计NALP3和MDA5两种受体的特异性引物，建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测NALP3和MDA5受体转录水平的方法，并用该方法检测了AJV-HF211毒株感染DF-1细胞后不同时间段内两种受体mRNA的转录水平。结果发现，与未感染的对照细胞相比，AJV-HF211毒株感染的DF-1细胞内NALP3和MDA5基因的转录水平均有不同程度的增加。其中，NALP3在病毒感染后第1~3d表达量逐步上升，在第4d时达到顶峰，而第5~7d表达量有波动，在5d后NALP3的表达量急剧下降。而MDA5在病毒感染组第1~3d时呈缓慢上升趋势，在第4d时表达量下降，第5~6d时表达又呈上升趋势，在第6d时达到最高值，而在第7d时表达量下降。提示，MDA5和NALP3受体在ALV-J感染过程中发挥重要作用，相关机理需要进一步验证。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

插图和附表目录

本文常用中英文缩写词

文献综述

引言

1材料与方法

1.1 疑似病鸡、鸡胚、细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂与培养基的配制

1.4主要仪器设备

1.5 ALV-J的分离

1.6 ALV-J的鉴定及其序列分析

1.7引物设计

1.8阳性标准品的制备

1.9 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

1.10 实时荧光定量RT-PCR检测AJV-HF211感染的DF-1细胞中NALP3和MDA5 mRNA的转录水平

2结果与分析

2.1 疑似患鸡的主要组织病变

2.2 鸡胚成纤维细胞分离ALV-J

2.3 p27群特异性抗原的检测结果

2.4 ALV-J的RT-PCR检测与鉴定结果

2.5 AJV-HF211分离株env基因的扩增与遗传进化分析

2.6 AJV-HF211分离株遗传进化分析

2.7 PCR检测NALP3和MDA5的结果

2.8 NALP3和MDA5重组质粒的构建和测序

2.9 Real-time PCR反应条件的优化及标准曲线的建立

2.10 阳性标准品的特异性

2.11 AJV-HF211感染DF-1细胞后NALP3和MDA5 mRNA的转录水平

3讨论

3.1 ALV-J env基因的变异

3.2 NALP3和MDA5在抗病毒免疫通路中的作用

结论

参考文献

致谢

作者简介