多拷贝木聚糖基因xyn-T的枯草芽胞杆菌整合表达载体的构建及其表达

摘要

我国作为一个养殖大国，饲料总产量位居世界第一。然而我国的特殊国情所致，其饲料资源相对匮乏，利用生物技术提高常规饲料的利用率，并且开发一些非常规性饲料用于拓宽饲料资源，将是极为重要的。近年来，内切木聚糖酶已多被广泛应用于饲料、制浆造纸和食品工业等，本研究基于木聚糖酶的重要价值和开发前景的广阔性，成功地转化了多拷贝木聚糖酶基因的枯草芽孢杆菌WB800N表达宿主，采用固体发酵的形式，外分泌出了内切木聚糖酶，并且对该酶进行了初步的酶学性质分析。
　　整合载体pHT43/Spo0A是本试验需要构建的目的载体，是以pHT43质粒为基础，以Spo0A基因作为单交换的同源片段，利用限制性内切酶位点Kpn I插入，得到整合载体pHT43/Spo0A。
　　研究发现，为了减少过载的外源高拷贝木聚糖酶基因对宿主的生长代谢的影响，人工将xynT基因内的碳水化合物结合区敲除，经过亚克隆，成功构建单拷贝载体。利用Xho I与Sal I作为同尾酶的特性，成功构建了一个包含三拷贝串联表达盒的穿梭载体pHT43(+)/3（xynT_CBD）。再将该载体转化Bacillus subtilis WB800N获得包含三拷贝xynT_CBD基因的重组枯草芽孢杆菌，qPCR进一步验证其正确性。
　　通过IPTG诱导蛋白表达，经SDS-PAGE和WB验证其正确性，定性地验证在21KD大小的特异性蛋白条带为外源木聚糖酶蛋白；经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，分析其酶学性质。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩写中文对照

插图

文献综述

1木聚糖的结构与来源

2木聚糖酶

3木聚糖酶的应用

4枯草芽孢杆菌表达系统概述

引言

1 材料与方法

试验一 多拷贝木聚糖酶基因扩增整合型载体的构建

试验二 枯草芽孢杆菌多拷贝木聚糖酶基因xynT整合型载体pHT43(+)/3（xynT_CBD）的转化及表达

试验三 枯草芽孢杆菌表达木聚糖酶的活力与酶学特性

2 试验结果

2.1 枯草芽孢杆菌Spo0A基因的扩增

2.2 整合性重组质粒的鉴定

2.3 木聚糖酶基因xynT_CBD的扩增

2.4 多拷贝木聚糖酶基因xynT扩增整合型载体的的鉴定

2.5 枯草芽孢杆菌阳性转化子木聚糖酶基因xynT_CBD的扩增

2.7 qPCR

2.8 SDS-PAGE图

2.9 Western-Blotting蛋白图

2.10 粗酶液酶活的测定结果

2.11 pH对木聚糖酶酶活的影响

2.12 温度对木聚糖酶酶活的影响

3 讨 论

3.1 枯草芽孢杆菌整合性表达载体的构建

3.2 多拷贝木聚糖酶基因xynT载体的构建

3.3 多拷贝整合载体的枯草转化及其验证

3.4 木聚糖酶的酶学特性

4 结 论

4.1 小结

4.2 创新点

4.3后续展望

参考文献

致谢

作者简介

研究生期间主要发表论文