灰毡毛忍冬种质评价以及药材质量和银黄配伍与金银花的比较研究

摘要

湖南省盛产的灰毡毛忍冬种植面积达到了三十多万亩，花蕾药材商品名“湘银花”，上世纪90年代末始产量一直占全国金银花市场份额的40％，产品销往全国各地。　　 灰毡毛忍冬的种植历史也已经有了三十多年了，经过三十多年的人工选择和自然选择，已经形成了许多农家品种品系等种质资源，但优劣混杂，良莠难分，品名混乱，给栽培和管理带来了许多困难；同时，人工选育良种时主要目标一直集中在药材产量等经济性状和株型等农艺性状方面，从未考察有效成分含量等内在品质。　　 目的：灰毡毛忍冬作为一种新资源，基础研究薄弱，该项研究，拟以山东、河南金银花道地药材作对照，开展灰毡毛忍冬的有效化学成分绿原酸，咖啡酸和挥发油含量以及抑菌、抗菌、解热等药理作用及其安全性比较研究，试图建立湘银花药材的质量标准体系；探讨灰毡毛忍冬与黄芩的药对配伍对主要有效成分的影响，研究并构建灰毡毛忍冬、金银花与黄芩药对配伍的HPLC指纹图谱；开展种质资源的遗传多样性和活性成分含量的比较研究，系统整理和科学评价灰毡毛忍冬种质资源、为良种选育和GAP种植提供科学依据。　　 方法：采用HPLC法测定有效成分绿原酸，咖啡酸的含量；采用共水蒸馏法提取挥发油成分，GC-MS法分析挥发油成分；采用琼脂扩散法、试管稀释法研究体外抑菌、杀菌作用；用NIH小鼠研究体内抗菌作用并测定其半数致死量LD50；用大鼠致热模型研究解热作用；采用HPLC法分别测定单味药材灰毡毛忍冬、金银花和黄芩及其共煮液中绿原酸、黄芩苷的含量，SPSS13.0 软件进行分析。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 版》对指纹图谱进行相似性分析；采用ISSR 标记研究灰毡毛忍冬种质资源的遗传多样性，并利用POPOGENE32 软件对扩增片段数据进行聚类分析；采用HPLC法对灰毡毛忍冬种质资源的绿原酸、咖啡酸、木犀草素、芦丁和金丝桃苷等活性成分的含量比较研究，构建灰毡毛忍冬“湘蕾金银花”的指纹图谱。　　 结果：　　 1、采自湖南省隆回县，溆浦县，新宁县种植基地的灰毡毛忍冬及河南，山东金银花种植基地和山东药材市场市售的金银花中绿原酸含量分别为3.9±0.4537,2.6±0.1408,4.5±0.0182,2.4±0.1913,2.1±0.1684,2.5±0.0506;灰毡毛忍冬中绿原酸的含量高于金银花；灰毡毛忍冬中咖啡酸的含量接近或略高于金银花；灰毡毛忍冬和金银花挥发油中均含有效成分芳樟醇（Linaiool）、香叶醇(Geraniol)和α-松油醇(α-Terpineol)等10个相同成分，其中芳樟醇的百分含量最高。　　 2、灰毡毛忍冬或金银花对金葡菌、乙型链球菌、大肠杆菌等六种菌皆有抑制作用，其中对金葡菌和乙型链球菌的抑菌作用最强，并且对金黄色葡萄球菌等均有杀灭作用；药材的最低杀菌浓度明显高于最低抑菌浓度，水煎剂的抑菌作用比浸泡剂强；隆回产灰毡毛忍冬抑菌作用最强；灰毡毛忍冬和金银花对金葡菌感染的小鼠有一定的保护作用，以隆回产灰毡毛忍冬效果最好；灰毡毛忍冬和金银花的解热强度相当。药材的毒性皆较小，其中灰毡毛忍冬毒性最小。　　 3、灰毡毛忍冬或金银花与黄芩配伍对其主要有效成分绿原酸、黄芩苷的含量均无影响。　　 4、以绿原酸为参照峰，灰毡毛忍冬和黄芩水提物与金银花和黄芩水提物指纹图谱共有12个指纹峰，灰毡毛忍冬和黄芩水提物指纹图谱共有14 个指纹峰，金银花和黄芩水提物指纹图谱共有13个指纹峰；同一药材不同批次的指纹图谱相似度都大于90％，十批灰毡毛忍冬和黄芩水提物指纹图谱与十批金银花和黄芩水提物指纹图谱的相似度基本上大于90％；灰毡毛忍冬水提物指纹图谱与金银花相比，多了4个峰，但峰面积很小，且与黄芩共煮后有两个峰消失。　　 5、对灰毡毛忍冬总DNA提取方法和PCR 反应体系进行了优化，建立了稳定可靠的品种鉴定方法，筛选出了15条有效引物，构建了灰毡毛忍冬的DNA 指纹图谱库；绘制了灰毡毛忍冬聚类树状图。18个样品分为两大类，一大类为忍冬，一大类为灰毡毛忍冬，灰毡毛忍冬又被分为五类：岩背的常规单独为一类，太湖1号、2号为第二类，龙潭湘蕾6号与湘蕾王2号为第三类，龙潭的常规为第四类，其余样品为第五类。　　 6、灰毡毛忍冬不同种质间各组分含量相差悬殊，绿原酸含量0.012-6.66％，样品间相差55.5倍；除1、2、4、7、13号样品外，其它样品均超过2005 版《中华人民共和国药典》的规定标准；木犀草素含量0.009-0.079％，样品间相差8.8倍，所有样品的含量均低于2005 版《中华人民共和国药典》的规定标准；咖啡酸含量0.003-0.399％，样品间相差133倍；芦丁含量0.014-0457％，样品间相差32倍多；金丝桃苷含量0.007-0.096％，样品间相差13.7倍；常规品种具有良好的内在品质；太湖一号、太湖二号、湘蕾王一号、湘蕾王四号、白云一号和花王一号各有效活性成分的含量均普遍较高：绿原酸远远超出2005年版《中华人民共和国药典》的规定标准，适于推广；构建了湖南灰毡毛忍冬湘蕾系列药材的指纹图谱，指纹图谱的相似度很高。　　 结论：　　 1、灰毡毛忍冬内在品质和药理作用等优于金银花，完全可以代替金银花使用。　　 2、灰毡毛忍冬种质资源丰富，不同种质间有效成分含量和内在品质相差悬殊。　　 3、银黄配伍中灰毡毛忍冬优于金银花。