阿胶低肽制备工艺及其质量控制方法研究

摘要

研究目的与意义：　　 阿胶是著名中药，以补血升血功效可靠而著称。但由于阿胶的主要成分85％以上是胶原蛋白，胶原蛋白口服后需要被蛋白酶降解为低肽或氨基酸后才能吸收。然而阿胶的适应症人群——血虚病人，往往是脾胃虚弱，消化能力低下，服用阿胶对其消化系统负担加重，消化功能进一步降低，阿胶药效也不能充分发挥。因此，阿胶素有“滋腻碍胃”之说。　　 另一方面，阿胶对于肿瘤病人由于放化疗导致的贫血（血虚）有较理想的疗效，但放化疗病人有严重的消化道副反应，呕吐、恶心使得病人服用阿胶变得非常困难。同时，化疗使得病人胃肠功能被严重削弱，消化能力大幅下降，将会进一步加剧阿胶的“滋腻碍胃”之弊。因此，研究易吸收的阿胶制剂，开发阿胶注射给药剂型是阿胶研发急需解决的重大问题。　　 研究阿胶的新制剂、新剂型必须解决阿胶及其新制剂的质量控制方法问题。目前阿胶质量标准没有特异性的定性定量方法，《中国药典（2005版）》仅有氨基酸含量测定等不能特异性控制阿胶原料、工艺等的指标。特别是近年来由于原料紧缺导致假冒伪劣产品较多，严重的影响人民群众安全有效的用药。研究阿胶特异性检测技术和方法，也是阿胶研究的重大而紧迫的课题。　　 本文基于：　　 1、阿胶成分85％以上是胶原蛋白，2、口服有效，3、蛋白类成分口服后必须被胃蛋白酶、胰蛋白酶降解为低肽或氨基酸才能被吸收，4,阿胶降解为氨基酸后已不能代表阿胶的药效等四点科学共识，提出了“阿胶的主要生物活性物质是阿胶含有的胶原蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后的、能被机体吸收且有良好生物相容性的阿胶低肽”的工作假说，在此基础上按照仿生学的理论运用生物酶提取阿胶药效物质-阿胶低肽，研制成注射用阿胶低肽冻干粉和易吸收疗效高的口服阿胶低肽。在研究阿胶新制剂、新剂型的同时，运用分子筛、HPLC-Ms、MALDI-TOF-MS、FAB-MS、ESI-MS等技术研究、测定了阿胶特征肽的氨基酸序列，对阿胶及其新制剂特异性质控方法进行了研究。　　 研究内容与结果：　　 一.不同分子量段阿胶低肽的制备　　 采用生物酶耦合膜分离技术提取纯化阿胶药效物质并制成注射用冻干粉：将阿胶制成胶浆，脱脂，脱脂胶浆先后用胃蛋白酶、胰蛋白酶降解，降解条件经优化为：胃蛋白酶酶量10万U/g、胃蛋白酶酶解时间为2小时、酶解pH2.0、酶解温度42℃；胰蛋白酶酶量为5千U/g、胰蛋白酶酶解时间3小时，酶解pH为8.0，酶解温度42℃。酶解液除酶，用分子量截流值为30kD、10kD、5kD、3kD、1kD的超滤柱超滤，获得相应的不同分子量段的阿胶低肽药液。不同分子量段的阿胶低肽药液分别通过大孔吸附树脂柱，去除杂质后，再用葡聚糖凝胶层析等手段进行了阿胶低肽的纯化。　　 二.以具有良好生物相容性和药效为指标，选择注射用阿胶低肽的分子量，　　 阿胶含有胶原蛋白，研制注射用阿胶低肽首先要考虑将阿胶胶原蛋白降解至具有良好的生物相容性，不得有任何过敏反应。同时为了保证阿胶的药效，阿胶胶原蛋白又不能完全降解为氨基酸。为此，本文首先对注射用阿胶低肽的分子量进行了选择。将各分子段的药液进行致敏性试验，确定注射用阿胶低肽的安全分子量为<3kD。用上述药液进行了药效学试验， <3kD的注射用阿胶低肽升高血色素、红血球、白血球的效果显著由于口服阿胶（口服阿胶剂量按氨基酸计算是<3kD注射用阿较低肽剂量的25倍的前提下）P<0.05。确定了注射用阿胶低肽分子量为<3kD，　　 三.以药效为指标，确定口服阿胶低肽的分子量　　 在确定了注射用阿胶低肽的分子段后，根据临床需要我们又以药效为指标，选择了口服阿胶低肽的分子量段，将<1kD、<3kD、<5kD、<10kD、<30kD的不同分子量段的阿胶低肽以同等剂量灌胃给药，比较其升高血色素、红血球、白血球的作用，结果显示，口服阿胶低肽以<5kD最佳。。　　 四. 阿胶低肽量效关系的建立　　 为了减少药效学实验较高的研究费用和繁重的工作量，是研究结果与将来生产实际紧密相结合，我们寻求以阿胶低肽量的比较取代药效强弱的比较，探索了注射用阿胶低肽的量效关系。结果显示：在实验的给药剂量范围内，阿胶低肽剂量(按氨基酸计算)与Hb和RBC提升程度呈正相关。同分子量段的阿胶低肽剂量的变化可以反映其药效强弱的变化。　　 五.阿胶低肽含量测定的方法学研究　　 进行了考马斯亮蓝法测定阿胶低肽的方法学考察（标准曲线为y=0.0054x+0.7316，牛血清白蛋白含量在0～80μg范围内线性关系良好，R=0.9991）并将含量测定与药效联系，以分子量<3kD的肽含量为指标，利用正交实验设计优选了阿胶的酶提取工艺，同时进行了药效验证实验，结论与采用含量测定的方法一致。　　 六.阿胶低肽的纯化　　 运用超滤、大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶层析等手段进行了阿胶低肽的纯化。阿胶酶提取液依次通过分子量截流值为30kD和3kD或5kD的超滤柱（<5kD组分即口服阿胶低肽可直接进行干燥），然后上大孔吸附树脂柱，洗脱收集低肽组分，低肽组分采用SephadexG-25柱纯化，得到纯化液置-40℃预冷2h后，冷冻干燥，即得阿胶低肽冻干粉。　　 七.阿胶特征肽的分离与结构测序　　 对阿胶低肽冻干粉溶液进一步分离，并进行了结构研究。采用SephadexG-25分离冻干粉水溶液，选择211nm作为检测波长，对流出液进行了单波长扫描。结果分离得到3个峰，弃去峰面积很小的1峰，选择第2、3峰收集。并对其进行了HPLC分离，测定了其图谱，结果发现3号峰的HPLC图谱较为稳定，通过制备性HPLC进行组分收集。进行了MALDI-TOF-MS检测，结果发现酶解时间对产物有较大影响。从另外一个角度说明阿胶低肽随着酶解时间的延长，先增多，后逐渐减少。同时证明主要的药效物质存在于分子量1000D～1900D。又由于近紫外干扰较为明显，采用了ESI-MS，该图谱不仅稳定,而且特征性强,可用于相关制剂中阿胶的快速指纹鉴别，结果2号峰的12min峰为一特征肽段，序列为GSEGPQGVR；3号峰的13min峰为一特征肽段，序列为PGEAGLPGAK。特征肽段的分析采用了FAB-MS法进行测定。　　 八.阿胶特异性鉴别方法的研究　　 1.旋光分析法：对阿胶及其伪品（马皮胶，牛皮胶）采用了旋光分析、结果显示，结果表明，驴皮胶旋光度= - 0.35，牛皮胶旋光度= - 0.38，马皮胶旋光度= - 0.39，杂皮胶旋光度均小于驴皮胶。但是含有20％杂皮的旋光度不能与纯驴皮胶鉴别。蛋白结合糖含量化学分析为测定在620nm下的吸收度，结果表明，驴皮胶A620nm=0.34，牛皮胶A620nm=0.31，马皮胶A620nm=0.44。该方法可以较好的　　 区分驴皮胶和马皮胶，但牛皮胶区分效果较差。　　 2.质谱特征峰分析法：利用MALDI-TOF质谱对三种胶进行扫描，不同皮胶的平均分子量不同，阿胶的平均分子量为28.5KD，牛皮胶和马皮胶均高于阿胶。但是由于制作工艺有可能对水解程度有影响，这种方法仅作一种参考。低分子量组分HPLC-MS方法分析稳定性和重复性好，但不同批次胶低分子量组分组成不稳定，且组分繁多，各组分均为未知，混合胶分析难度高。但3号峰图谱中马皮胶在11min处多出一峰，是马皮胶的特征峰。酶解物组分HPLC-MS分析尽管数据量很大，但是图谱稳定，且能在牛皮胶中发现特征肽。单纯采用酶解物进行分析。在乙腈-水体系中，驴皮胶的峰较具有特征，且重复性良好；在三氟乙酸体系中，马皮胶的峰较具有特征，且重复性良好；是一种鉴定的新途径。　　 九.初步药效试验和安全性评价　　 初步药效学实验（升血作用实验、免疫增强实验、抗疲劳实验）证明，本文工艺制备的注射用阿胶低肽、口服阿胶低肽，在提升Hb、RBC、WBC方面均显著优于阿胶，有较好的免疫增强作用。且无致敏性，无明显毒副作用。　　 本文创新点：　　 1.运用仿生学的理论和方法，对阿胶进行生物酶降解，从其降解产物中分离低肽类有效成分，解决了胶原蛋白类成分分离纯化、结构解析难度大，无法注射给药的问题，为动物胶类乃至蛋白类中药的深入研发提供了新思路、新方法。　　 2.首次从阿胶的酶降解产物中分离到两种特征肽，并进行了结构测序，这对阿胶研究具有非常重要的意义，也为化学合成或基因表达着两种肽打下了基础。　　 3.首次建立了阿胶特异性的检测方法，用MALDI-TOF-MS和HPLC-MS等技术发现了特征肽。为中药阿胶及其制剂的鉴定、开发研究和质量标准的研究提供新技术与实践基础。　　 存在问题：　　 进一步研究阿胶新制剂对血虚证之外的其他病症的作用。　　 阿胶低肽的致敏作用评价应选用多指标进行，以增加可靠性。