柞蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制基因克隆及表达特征分析

摘要

丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）在生物体内能与丝氨酸蛋白酶相互制约，调节丝氨酸和半胱氨酸酶的活性，调节丝氨酸蛋白酶活性，形成一定的动态平衡，是一种调节剂，参与抗凝血、生殖、抑制过度自我吞噬、抗菌、免疫应细胞分化、凋亡、组织重建及免疫等重要过程。丝氨酸蛋白酶抑制剂根据分子中的疏水中心、形成二硫键的架桥结构、序列是否同源性相似和他们本身结构的紧凑性主要分为Hinudim家族、Stefins家族、Cystatins家族、Cysteine proteinase inhibitors家族及Squash seed inhibitors家族等，为一类蛋白超家族。
　　本研究基于前期柞蚕cDNA文库获得的部分序列设计引物利用RACE PCR方法克隆了柞蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kazal-type.KSPI), ApKTSPI基因的cDNA序列并进行序列分析，柞蚕ApKTSPI基因的cDNA全长568 bp，含54 bp5’非编码区和223 bp3’非编码区，开放阅读框为291bp编码96个氨基酸，含18个氨基酸（MKATTLIIFAVLFVAVNC）的信号肽和一个Kazal结构域。和印度柞蚕亲缘关系最近，其次亲缘关系比较近的是罗奴霉素毛虫（Lonomia obliqua），而与半翅目、双翅目及鳞翅目昆虫的亲缘关系较远。利用实时定量PCR检测到ApKTSPI基因在柞蚕5龄幼虫的脂肪体中特异性的高表达，其次是马氏管，而在表皮、血细胞、丝腺和中肠中表达量相对较低。分别用柞蚕核型多角体病毒（NPV）、细菌（Escherichia coli）和真菌（Beauveria bassiana）3种不同的病原物免疫刺激柞蚕5龄幼虫，利用实时定量PCR检测到柞蚕5龄幼虫脂肪体中ApKTSPI基因在核型多角体病毒（NPV）、大肠杆菌（E. coli）和白僵菌（B. bassiana）免疫刺激后表达量都能上调，但上调的程度和时间都不同。利用表达载体pET28a构建了重组质粒pET28a-ApKTSPI，转化大肠杆菌BL21后利用IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果表明ApKTSPI蛋白在大肠杆菌中成功诱导表达，并且IPTG浓度在0.2 mM时ApKTSPI表达量最高。
　　本研究获得了柞蚕ApKTSPI基因的cDNA全长，并研究了ApKTSPI基因在组织及病原物免疫刺激后表达模式，为进一步研究其在柞蚕免疫中的功能及作用机理奠定了基础。

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1 文 献 综 述

1.1先天免疫

1.2细胞免疫

1.3体液免疫

1.4蛋白酶抑制剂简述

1.5丝氨酸蛋白酶抑制剂分布

1.6丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类

1.7其他相关免疫基因简述

2 引 言

2.1 研究的目的及意义

2.2研究内容

3 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 仪器与试剂

3.3 实验方法

4 结 果

4.1 ApKTSPI基因克隆与序列分析

4.2 ApKTSPI基因在柞蚕幼虫组织的表达分布

4.3 免疫刺激后ApKTSPI基因在柞蚕幼虫脂肪体中的表达

4.4 ApKTSPI的原核表达

5讨论

6 结 论

参考文献

致谢

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