淮南麻黄鸡B-F基因多态性种群特征分析与表达产物的抗原性研究

摘要

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex class）是存在于脊椎动物特定染色体上的具高度多态性的一组基因群，其编码产物为免疫分子，可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分子。其中，鸡I类分子为B-F。α链具有高度多态性，主要由4个结构域组成，即信号肽、胞外区（α1、α2和α3）、跨膜区（TM）和胞浆区（Cyt）。在α1与α2区域内存在肽结合区（PBR），它能与抗原短肽结合。MHC分子多态性引起动物机体对特定病原体抵抗力的不同，还能干扰生长发育等经济性状。鸡不同品种在进化中因分布于不同区域，受到不同环境因素包括疫病等压力影响，形成了外形、生产性能等方面的较大差异。MHC分子在演变中也受到影响。在各类研究中，安徽地方品种淮南麻黄鸡Mhc基因特性未有涉及。为此，本研究对淮南麻黄鸡Mhc I（B-F）进行了分子克隆，研究了该分子的特征以揭示该品种的MHC分子进化规律。
　　首先，抽提淮南麻黄鸡50羽个体的血细胞总RNA，之后扩增cDNA，连接载体后转化感受态细胞，挑阳性克隆送测序鉴定。结果显示，克隆到大小分别为1136bp的B-FA基因片段和396bp的B-FB基因片段，测序获得了34条B-FA的cDNA序列和15条B-FB的cDNA序列。应用生物信息学软件分析B-FA和B-FB基因结构和多态性特征，结果表明，B-FA的 ORF大小有两种，一种大小为1068bp，另一种大小是1035bp，分别编码356个氨基酸(aa)和345个aa。经比对分析发现，两者都含有信号肽(21aa)、α1(88aa)、α2(91aa)和α3(91aa)，不同之处在TM/Cyt区域，是由于第7外显子缺失。相比之下B-FB基因则比较保守。
　　其次，构建含B-F基因的重组质粒，转化大肠杆菌后诱导表达。SDS-PAGE电泳表明，B-FA基因表达产物以包涵体形式存在为主，B-FB基因表达产物以可溶性蛋白的形式存在为主。它们的分子量分别为52.1kDa、33.0 kDa。用纯化的蛋白免疫小鼠，获得了鼠抗鸡B-F多克隆抗体，并通过免疫印迹进行了抗体的特异性检测，表明抗体能与目的蛋白特异性结合。
　　最后，构建含B-F基因的重组真核质粒，转染293T细胞，随后观察瞬时表达特性，发现它们均能在细胞浆膜区表达定位。
　　以上结果为进一步研究淮南麻黄鸡分子进化规律、B-F分子携带抗原肽的原理及后续基因疫苗的制备提供了实验基础。

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主要符号表

文献综述

1.1 MHC分子的起源

1.2 MHC I分子的结构

1.3 MHC I类分子的分布

1.4 MHC I分子的遗传特性

1.5 MHC I分子的生物学功能

1.6 MHC分子与疾病的关系

1.7家禽MHC I类分子研究进展

引言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 B-F分子的克隆及序列分析

2.2 B-F分子原核表达

2.3 鼠抗鸡多克隆抗体的制备及鉴定

2.4 MHC I类分子真核表达

3讨论

3.1 地方品种淮南麻黄鸡的选择

3.2 鸡B-F分子序列特征

3.3 原核表达蛋白的优化

4 结论

参考文献

致谢

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