ALV-J体内感染诱导NLRP3炎症体和MDA5介导的天然免疫反应

摘要

J亚群禽白血病病毒（Avian leucosis virus subgroup J，ALV-J）属于反转录病毒，可以引起鸡免疫抑制和多发性肿瘤。由于ALV-J变异速度快，机体较难获得有效的免疫保护，目前尚无防治该病的有效疫苗。天然免疫是机体抗感染的首要防线，病毒入侵后会被天然免疫系统识别，进而引发相关免疫通路的活化和抗病毒反应。天然免疫识别受体中Nod样受体(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)在抗RNA病毒中发挥着重要作用。本研究对ALV-J感染早期时黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)及核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)家族成员NLRP3炎症转导通路及调控机制进行探讨，为揭示ALV-J致病机制和宿主抗病毒免疫机制提供参考。
　　首先，将本实验室分离的ALV-J临床株（命名为AJV-HF211）进行DF-1细胞增殖和鉴定，再将70只1日龄SPF鸡随机分为两组，攻毒组42只，对照组28只，经颈部皮下接种ALV-HF211细胞毒，0.2mL/只，2x104TCID50/mL，对照组接种细胞培养液，0.2mL/只。在感染不同天数后（days post infection，dpi）剖检观察病变，取肝脏制备石蜡切片。结果表明，攻毒组鸡胸腺出血、萎缩，肝脏和脾脏有出血点，胆囊萎缩、胆汁量少且呈淡黄色。此外，AJV-HF211毒株感染组织中炎性细胞增殖明显。
　　其次，通过RT-PCR方法检测鸡肝组织中病毒的核酸片段并设计扩增MDA5、NLRP3及其下游caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特异性引物，进一步建立SYBR GreenⅠ实时荧光相对定量 RT-PCR检测方法（RT-qPCR），分别检测感染组和对照组鸡肝组织内的MDA5、NLRP3及其下游接头分子和细胞因子的转录水平。RT-PCR检测ALV-J结果表明，在感染9dpi，首次检测到ALV-J特异性基因片段，且9-17dpi期间均能检测到该片段的存在。RT-qPCR结果表明，与未攻毒的对照组相比，AJV-HF211毒株感染可诱导鸡体内 MDA5、NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β和IL-18基因的转录水平均有不同程度增加，而IFN-β和IFN-γ的表达无明显变化。其中，NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表达变化不明显，而在5-7 dpi时明显升高（p<0.01），在9dpi开始下降；IL-1β和IL-18在1-5dpi无明显变化，在7-17dpi表达量明显升高（p<0.05）。这表明炎症初期NLRP3转录水平显著增加，且变化趋势和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi时变化不明显，但在7-17dpi保持较高转录水平趋势。上述结果提示，NLRP3/caspase-1炎症通路和MDA5受体在 AJV-HF211感染早期可能发挥重要作用，而AJV-HF211毒株可能通过负向调控干扰素诱生机制逃逸免疫应答。
　　最后，将鸡饲养至240日龄，观察肿瘤发生情况，并取肝脏组织制作石蜡切片， HE染色观察细胞状态。结果表明，AJV-HF211毒株感染部分鸡精神萎靡，食欲不振，羽毛蓬乱，伴有腹泻消瘦，贫血等症状；剖检观察到肝脏、心脏、卵巢均有实质性增生物出现。石蜡切片HE染色结果表明，攻毒组肝脏有明显的肿瘤灶，表现为髓细胞瘤和血管瘤。此外，还可见淋巴样细胞浸润，肝细胞索消失，细胞核崩解等病理变化。上述结果表明，本实验室AJV-HF211分离毒株经人工感染可对部分感染鸡具有致瘤性，其致瘤作用可能与鸡本身抗性有关。
　　综上所述，AJV-HF211毒株感染早期和后期均可导致病鸡发生明显病变，并具有致瘤性。在感染早期时可诱导MDA5及NLRP3/caspase-1炎症通路的明显上调，但IFN-β和IFN-γ诱生受阻，这可能与ALV-J免疫逃逸有关。

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文献综述

1J亚群禽白血病

2 ALV-J病毒基因结构及其特点

3 ALV-J流行病学特点

4 病毒致病致瘤性

5 免疫抑制的主要机理

6 抗病毒天然免疫、感染性炎症和肿瘤的关系

7 抗病毒天然免疫的模式识别受体

8 研究目的与意义

引言

1材料与方法

1.1 实验动物和病毒来源

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 主要试剂与培养基的配制

1.5 ALV-HF211的增殖与鉴定

1.6 SPF鸡胚的孵化

1.7 SPF鸡攻毒实验

1.8 引物设计

1.9 肝脏总 RNA提取

1.10 基因组DNA的去除和cDNA第一链的合成

1.11 重组质粒的构建

1.12 SYBR Green I荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）方法的建立

1.13 RT-qPCR检测MDA5、NLRP3/caspase-1炎症通路的转录水平

1.14 石蜡切片的制备和染色

2结果与分析

2.1 感染DF-1细胞的ALV-HF211毒株鉴定

2.2 鸡肝脏总 RNA提取结果

2.3 感染后不同时间点肝脏中病毒的增殖情况

2.4 病毒感染早期（1-17dpi）肝组织的病理变化

2.5 caspase-1、IL-1β和IL-18重组质粒的构建及目的基因检测结果

2.6 RT-qPCR 方法的建立

2.7 病毒感染早期（1-17dpi）肝组织中相关基因转录水平的变化

2.8 病毒感染后期的病理变化和致瘤性

3讨论

3.1 ALV-J人工感染

3.2 抗病毒免疫信号通路

4结论

参考文献

致谢

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