副猪嗜血杆菌Wza基因缺失株的构建及生物学特性研究

摘要

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPs）是猪体内的条件性致病菌，毒力菌株可引起猪以纤维素性渗出为主的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。荚膜一直被认为是HPs的一种重要毒力因子，荚膜多糖运输蛋白基因Wza在HPs中已被鉴定出来，但目前对HPs的Wza基因研究并不深入，其功能以及与其他相关基因的关系还未被阐明。为了研究HPs的Wza基因与荚膜形成的关系以及对荚膜毒力的影响，本课题试验构建了Wza基因缺失株，通过生长速率，菌体形态，抗吞噬试验，小鼠毒力试验，血清抗性试验以及药敏试验等生物学特性方面对比了野毒株与Wza基因缺失株之间的差异性，来探究Wza基因，HPs荚膜的形成以及HPs毒力变化的关系。主要试验成果如下：
　　以ZJ1208菌株和pET-28质粒为基因模板，pUC-18质粒为载体，通过重叠PCR法构建同源重组质粒pUC18-LR-Kan；再通过自然转化法，将pUC18-LR-Kan分别转化5个HPs菌株中，通过PCR和测序鉴定，最终成功获得了Wza缺失的HPs菌株ZJ1208-△Wza。Wza基因缺失和野毒株在菌落形态上没有明显差别；但ZJ1208野毒株的生长速率和活菌数浓度均高于ZJ1208-△Wza缺失株，在约培养12h时两者OD600都达到最大值，其分别为2.196和1.246；二者活菌数在约8 h达到最大，其活菌数对数值分别为9.7634和9.3222。另外荚膜染色表明，ZJ1208-△Wza缺失株和ZJ1208野毒株都可形成较薄的荚膜层，但ZJ1208-△Wza缺失株可形成长链状菌体和长杆状菌体，而ZJ1208野毒株则不能；沉降试验中，ZJ1208-△Wza缺失株菌液在静置2h即可出现肉眼可辨的菌体沉淀，而 ZJ1208野毒株菌液在整个实验过程中不出现沉淀现象。对抗生素的敏感性试验中，Wza基因的缺失使菌体对β-内酰胺类相较ZJ1208野毒株表现出了更高的敏感性。细胞吞噬试验、小鼠攻毒试验和抗血清杀伤试验分别进一步说明了 Wza基因的缺失能够减弱菌体抵抗细胞的吞噬和血清的杀伤作用，以及减弱对小鼠的侵袭性和致死性。

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缩略词表

文献综述

1 HPs概述

2 HPs相关毒力因子研究进展

3 HPs和其他细菌荚膜毒力因子相关研究

引言

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1同源重组质粒pUC18-LR-Kan的构建

2.2 pUC18-LR-Kan同源重组质粒的大量制备

2.3自然转化法转化HPs

2.4 ZJ1208-△Wza株与野毒株的生物学特性比较

3讨论

3.1 HPs Wza基因缺失株的构建

3.2 ZJ1208野毒株和ZJ1208-△Wza缺失株生物学特性的比较

4结论

参考文献

致谢

附录

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