草莓镶脉病毒运动蛋白功能域分析及其胞内运动机制研究

摘要

植物病毒侵入寄主，先在细胞内大量复制，经过胞内、胞间的横向运输和维管束长距离径向运输，才能成功系统侵染寄主。这个过程涉及病毒自身特异性编码的运动蛋白（movement protein, MP）。研究表明，草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）编码的P1蛋白是一个运动蛋白，但是病毒进入寄主体内如何进行胞内、胞间和长距离运动机制尚不明确。本课题分析和鉴定了MP蛋白的功能域，并研究了SVBV MP蛋白的胞内运动机制，为进一步研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基础。
　　1. SVBV MP蛋白功能域的预测
　　利用软件分析了SVBV MP蛋白的功能域，发现119 aa-233 aa为运动相关的关键区域，而30 aa-55 aa和283 aa-329aa是蛋白互作的关键区域。
　　2. SVBV MP蛋白运动相关功能域的鉴定
　　为了确定MP蛋白的功能域，构建了3个缺失突变体pCV-MP?30-55-YFP、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP。
　　（1）MP缺失突变体的亚细胞定位含pCV-MP-YFP、pCV-MP?30-55-YFP、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP和pCV-YFP的农杆菌浸润本氏烟，发现 MP及其突变体 MP?30-55和 MP?283-329均能够定位在细胞壁上，而突变体MP?119-233定位在细胞质和细胞核上。说明 MP蛋白119 aa-233 aa区域是决定MP运动相关的功能域。
　　（2） MP缺失突变体的运动回补功能含 pPVX-?P25-GFP、pPVX-?P25-GFP+pBin438、pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?30-55、pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?119-233和 pPVX-?P25-GFP+pBin-MP?283-329的农杆菌浸润本氏烟，发现MP、MP?30-55和MP?283-329能够互补运动缺陷型PVX载体，绿色荧光能从单个细胞向外扩散至3-4个细胞乃至整个叶片。表明MP蛋白119 aa-233 aa是决定MP运动相关的功能域。
　　3. SVBV MP蛋白与P4蛋白互作相关功能域的鉴定
　　（1）酵母双杂交验证互作功能域质粒 pGBK-MP?30-55+pGAD-P4、pGBK-P4+pGAD-MP?30-55、pGBK-MP?119-233+pGAD-P4、pGBK-P4+pGAD-MP?119-233、pGBK-MP?283-329+pGAD-P4和pGBK-P4+pGAD-MP?283-329分别共转化酵母，发现pGBK-P4+pGAD-MP?119-233共转化的酵母细胞能够在选择培养基上生长。表明MP30 aa-55 aa和283 aa-329 aa是与P4蛋白互作的关键功能域。
　　（2）双分子荧光互补验证互作功能域含pCV-nYFP-MP?30-55+pCV-cYFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?30-55、pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-cYFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?119-233、 pCV-nYFP-MP?283-329+pCV-cYFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-MP?283-329的农杆菌分别共浸润本氏烟，发现浸润pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-cYFP-P4农杆菌的本氏烟表皮细胞中出现黄色荧光，说明SVBV MP30 aa-55 aa和283 aa-329 aa是与P4蛋白互作的关键功能域。
　　4. SVBV MP蛋白的胞内定位
　　含质粒pCV-MP-YFP的农杆菌浸润本氏烟，发现MP蛋白形成的点颗状物存在于细胞壁和细胞质中，而且MP形成的点颗状物在细胞质中能够沿着某种轨迹移动，最终定位于胞间连丝（PD）。表明 MP蛋白形成的点颗状物在细胞质中沿着某种轨迹靶向PD。
　　5. SVBV MP蛋白与微管的共定位
　　含质粒pCV-MP-YFP和pCV-MT-RFP的农杆菌共浸润本氏烟，发现MP蛋白能够和微管（MT）共定位。用微管抑制剂处理本氏烟表皮细胞后，再浸润含质粒pCV-MP-YFP和pCV-MP-YFP+MT-RFP的农杆菌，发现MP蛋白任然能够和微管（MT）共定位，只是靶向胞间连丝（PD）的MP蛋白数量明显减少。表明SVBV MP蛋白靶向PD与细胞骨架微管的结构有关，但是微管不是MP蛋白胞内运输的唯一途径。
　　6. SVBV MP蛋白与微丝的共定位
　　含质粒 pCV-MP-YFP和 pCAM-ABD2-GFP的农杆菌共浸润本氏烟，发现MP蛋白能够和微丝（ABD2）共定位，说明SVBV MP蛋白靶向PD与细胞骨架微丝有关。
　　7. SVBV MP蛋白与内质网的共定位
　　含质粒pCV-MP-YFP和pCV-ER-RFP的农杆菌浸润本氏烟，发现MP蛋白能够和内质网（ER）共定位，说明SVBV MP蛋白靶向PD与内质网有关。
　　8. SVBV编码蛋白间的互作
　　质粒 pGBK-P3+pGAD-P4和 pGBK-P4+pGAD-P3分别共转化酵母，发现SVBV P3与P4蛋白互作。含pCV-nYFP-P2+pCV-cYFP-P3、pCV-nYFP-P3+pCV-cYFP-P2、 pCV-nYFP-P3+pCV-cYFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-cYFP-P3的农杆菌共浸润本氏烟，发现P2和P3以及P3和P4能够互作。说明SVBV包裹核酸形成的病毒粒子的CP蛋白（P4）能够与P3蛋白互作，在蚜传蛋白（P2）与P3作用下将病毒粒子带入寄主体内，然后病毒粒子在 MP-P4作用下，沿着细胞骨架和内质网在胞内运动。

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文献综述

1 草莓镶脉病毒研究现状

2 SVBV MP蛋白运动机制研究

引言

材料与方法

1 供试材料

2 试验方法

结果与分析

1 SVBV MP基因克隆与载体构建

2 SVBV MP蛋白功能域预测

3 SVBV MP蛋白运动与互作相关功能域鉴定

4 SVBV MP蛋白亚细胞定位

5 SVBV MP蛋白与微管共定位

6 SVBV MP蛋白与微丝共定位

7 SVBV MP蛋白与内质网共定位

8 SVBV编码蛋白间的互作

讨论

1 SVBV MP蛋白功能域分析

2 SVBV MP蛋白亚细胞定位分析

3 SVBV MP蛋白与微管共定位

4 SVBV MP蛋白与微丝共定位

5 SVBV MP蛋白与内质网共定位

6 SVBV病毒蛋白间的互作

总结

参考文献

致谢

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