氧化应激下ABCG2基因对山羊睾丸支持细胞的影响及作用机制

摘要

支持细胞(Sertoli cell)为生精细胞的分化成熟提供支架，供给生精过程所需的营养物质及能量，其次还可分泌多种蛋白及生长因子，具有天然的免疫豁免功能，是血睾屏障的重要组成部分，因其独特的生物学特性，目前多用于组织工程、细胞疗法，为细胞移植及糖尿病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景。但在用于细胞移植时，需对支持细胞进行体外培养，体外培养细胞过程是一个静态系统，各种化学反应中会产生过量的活性氧簇(ROS)，导致细胞受氧化应激的影响而死亡。近来研究表明，ATP结合盒转运蛋白G2(ATP-binding cassette transporters G2，ABCG2)广泛定位于各种细胞质膜上，能够转运和外排有害物质，尤其对促进和维持应激状态下细胞的稳定增殖方面具有重要作用，而Nrf2信号通路可调节ABCG2基因的转录，是细胞对抗氧化损伤的核心途径之一，因此，研究在氧化应激条件下ABCG2基因对体外培养的支持细胞稳定增殖的影响及作用机制具有一定意义。
　　本试验首先构建山羊睾丸支持细胞(goat Sertoli cell，GSC)的氧化应激模型，研究在氧化应激状态下ABCG2基因在GSC内的表达和定位情况，阐明ABCG2基因对GSC稳定增殖的影响;进而加入ABCG2基因的抑制剂，检测ABCG2在Nrf2信号通路中对GSC稳定增殖的调控，以明晰氧化应激下ABCG2基因对GSC稳定增殖的影响及其作用机制。
　　第一，以GSC为研究对象，分别加入不同浓度的H2O2，作用4h后，检测各组GSC的存活率、脂质过氧化产物的含量、超氧化物歧化酶的活性，对GSC进行核型分析并用流式细胞仪进行异倍体检测。结果显示，构建GSC氧化应激模型的最佳条件是200μM H2O2处理细胞4h。
　　第二，分别对对照组和氧化应激组的GSC进行RNA提取，反转录成DNA作为模板，根据Genbank中获得的ABCG2基因序列合成引物，普通PCR扩增，运用荧光定量PCR技术和免疫组化技术对ABCG2进行表达和定位，并进行显著性分析，结果显示ABCG2基因在对照组和氧化应激组中均有表达，且表达量存在显著差异，氧化应激组ABCG2基因的表达量显著高于对照组(P＜0.05)。
　　第三，对氧化应激组的GSC加入ABCG2的抑制剂进行处理，然后进行RNA提取，反转录成DNA作为模板，根据Genbank中获得的Nrf2信号通路上的Nrf2、HO-1、NQO1基因序列合成引物，普通PCR扩增，运用荧光定量PCR技术进行表达并进行显著性分析，结果显示加抑制剂组Nrf2、HO-1、NQO1基因的表达量均高于对照组，同时低于氧化应激组。
　　综上所述，本试验成功构建GSC的氧化应激模型，并探讨了氧化应激下ABCG2基因在GSC内的表达和定位，加入ABCG2的抑制剂后，发现Nrf2信号通路上关键基因的表达量均发生了相应变化，推测ABCG2基因可能处于Nrf2信号通路HO-1、NQO1基因的下游。以此为体外培养GSC维持其稳定增殖提供理论依据，并为后期实际生产中寻找合适靶点调控体外培养细胞氧化应激状态开辟新途径。

目录

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致谢

摘要

插图和附表清单

缩写和符号清单

文献综述

1 支持细胞

2 氧化应激

2．1 氧化应激产生的原因及作用

2．2 氧化应激的指示剂

3 Nrf2信号通路

4．1 ABCG2的结构

4．2 应激状态下ABCG2蛋白对细胞增殖的影响

5 ABCG2在Nrf2信号通路中对细胞稳定增殖的调控

6 结语

引言

1 材料与方法

1．1 试验材料、试剂与仪器

1．1．1 试验细胞来源

1．1．2 主要试剂

1．1．3 主要试验设备

1．1．4 常用试剂及配置

1．2 试验方法

1．2．1 GSC氧化应激模型的建立

1．2．2 氧化应激下ABCG2基因在GSC内的表达和定位

1．2．3 氧化应激时ABCG2在Nrf2信号通路中对GSC稳定增值的调控机制

1．3 数据分析

2 结果与分析

2．1 GSC氧化应激模型的建立

2．1．3 培养液中添加不同浓度的H2O2对GSC核型稳定性的影响

2．1．4 培养液中添加不同浓度的H2O2对GSC DNA倍体的影响

2．2 氧化应激下ABCG2基因在GSC内的表达和定位

2．2．2 cDNA完整性鉴定

2．2．4 实时荧光定量PCR结果和分析

2．2．5 氧化应激下ABCG2基因在GSC上的表达和定位

2．3．2 cDNA完整性鉴定

2．3．4 实时荧光定量PCR结果和分析

3 讨论

3．1 GSC氧化应激模型的建立

3．2 氧化应激下ABCG2基因在GSC内的表达和定位

3．3 氧化应激时ABCG2基因在Nrf2信号通路中对GSC稳定增值的调控机制

4 结论

参考文献

附录