猪圆环病毒2型悬浮培养规模化生产工艺初探

摘要

猪圆环病毒相关性疾病(PCVAD)是指断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PNDS)、猪呼吸系统混合疾病及繁殖障碍的总称。研究证明，猪圆环病毒2型(PCV2)是引起PCVAD的主要病原体。猪对PCV2具有较强易感性，而且传播途径多样。本病无特效的治疗方法，对猪进行疫苗接种是预防猪圆环病毒2型感染的有效手段。目前养殖场使用较多的疫苗包括亚单位疫苗、嵌合病毒灭活疫苗及全病毒灭活疫苗。PCV2全病毒灭活疫苗需要突破的工艺难点是圆环病毒的培养。传统的转瓶培养工艺，由于受细胞增殖面积、营养供应及气体交换等条件的限制，病毒增殖数量较少，导致下游工艺需要进行病毒浓缩才能达到配苗标准，然而浓缩工艺会造成杂蛋白富集，增加免疫应激的比例，不能有效满足养殖场对该疫苗的需求。在PCV2全病毒灭活疫苗研究中引入微载体悬浮培养技术，可以提高单位体积内的细胞量和产毒量，从有效性、稳定性和安全性等多方面对疫苗质量进行提升。
　　本研究应用生物反应器对PCV2的微载体悬浮培养进行了系统研究。对PCV2增殖的猪肾细胞（PK-15A）的悬浮培养工艺进行了研究，优化微载体使用浓度、细胞接种量、细胞初始搅拌方式、生长阶段搅拌速度和培养基补给方式等关键技术参数。优化反应器内的细胞消化参数，摸索并建立该细胞在反应器内的消化工艺。优化病毒接种剂量(MOI)、维持液血清浓度、溶氧参数及培养温度参数。
　　细胞培养工艺:确定载体浓度为3g/L，细胞接种量为10cells/micro-carrier，初始接种搅拌参数为加入细胞后补充培养基至1/3培养体积、初始转速为20r/min、培养2h后补足培养体积，搅拌速度设为30r/min，培养基补给方式为培养2日换一半营养液，细胞长势良好，培养细胞峰值达到1.5×106-2×106cells/mL。消化工艺:PBS清洗2次，每次1L清洗液，微载体上消化脱落的细胞超过85％，达到预期效果。病毒培养工艺:0.1MOI、2％血清浓度的维持液、40％溶氧量、37℃，连续培养收获至F9维持液，自F2起，各代次维持液的病毒滴度均不低于1055TCID50/mL，最高可达到107.5TCID50/mL。
　　PK-15A细胞在生物反应器上微载体悬浮培养效果良好，达到了国内外同类技术实现的较高细胞培养密度。实现PK-15A细胞在瑞士比欧反应器中逐级放大（16L-85L-500L）。实现PCV2悬浮培养规模化(500L)连续收获工艺，提高了病毒培养效价，节约了生产成本。

目录

声明

致谢

摘要

附表和插图清单

缩略词表

文献综述

引言

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 毒株与细胞系

1．1．2 相关试剂

1．1．3 主要器材

1．2 方法

1．2．1 微载体浓度优化

1．2．2 细胞接种量优化

1．2．3 细胞接种初始搅拌参数优化

1．2．4 细胞生长搅拌速度优化

1．2．5 培养基补给方式优化

1．2．6 工艺的验证

1．2．7 悬浮培养用细胞种子批的建立

1．2．8 悬浮培养用细胞种子批的鉴定

1．2．9 细胞罐内消化工艺优化

1．2．10 PCV2增殖接毒剂量优化

1．2．11 PCV2增殖维持液血清浓度优化

1．2．12 PCV2增殖最佳溶氧量优化

1．2．13 PCV2增殖温度优化

1．2．14 PCV2增殖工艺的验证

1．2．15 PCV2种毒批的建立

1．2．16 PCV2种毒批的鉴定

1．2．17 PCV2在500L(BR13)反应器上的增殖工艺验证

2 结果

2．1 微载体使用浓度优化结果

2．2 细胞接种量优化结果

2．3 细胞初始搅拌参数优化结果

2．4 细胞生长阶段搅拌速度优化结果

2．5 培养基补给方式优化结果

2．6 工艺的重复验证结果

2．7．1 细胞培养形态观察

2．7．2 细胞种子库信息

2．8．1 细胞纯净性检验结果

2．8．2 病毒培养适应性检验结果

2．10 PCV2增殖接毒剂量优化结果

2．11 PCV2增殖维持液血清浓度优化结果

2．12 PCV2增殖最佳溶氧参数确定结果

2．13 PCV2增殖温度优化结果

2．14 PCV2增殖最优参数重复验证结果

2．15 PCV2种毒批建立

2．15．1 PCV2基础毒种的繁殖及TCID50测定

2．15．2 PCV2不同代次毒种冻存信息

2．16 PCV2种毒批鉴定结果

2．16．1 病毒基因鉴定

2．16．2 纯净性检验

2．17 PCV2在500L(BR13)反应器上的增殖工艺验证

3 讨论

结论

参考文献

附录

硕士期间发表的论文

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