PEDV感染动物模型的建立及仔猪脏器带毒情况的研究

摘要

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是猪的一种高度接触性肠道传染病，其病原是猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)，该病主要引起哺乳仔猪呕吐、腹泻为临床特征，该病毒感染仔猪可引起高达100％的死亡率，是目前全球范围内猪场多发的传染病之一。2010年10月以来，猪流行性腹泻病毒的蔓延散播使得该病的流行不断扩大、危害强度不断增大。
　　疫苗免疫是PED防制的重要手段，然而效果尚不确切，时有报道PEDV免疫过的猪场时爆发PED。PEDV疫苗免疫效果的进一步科学评价成为必要。本研究拟建立PEDV感染动物模型，为进一步PEDV疫苗免疫评价提供物质保障，并通过对感染仔猪脏器带毒情况进行鉴定，为PEDV感染机制及生物安全防控研究提供理论基础。
　　首先本研究建立了PEDV荧光定量RT-PCR定量检测方法，通过设计合成适用荧光定量RT-PCR的PEDV N基因引物，构建PEDVN基因重组质粒，制备了荧光定量RT-PCR标准品质粒，绘制标准曲线(R2=0.999)，，其线性关系表达式为Y=-3.238X+44.460，从而利用该标准曲线测定了PEDV病毒液的病毒拷贝浓度，结果显示病毒液的病毒拷贝浓度为108.62拷贝/uL，为PEDV感染动物模型的建立提供了准确浓度的实验材料。
　　其次本研究对新生仔猪人工喂养条件进行了一定的摸索，通过选用不同的饲喂工具、奶水浓度以及环境温度的调控等诸多方面对仔猪的人工喂养条件进行了有效的优化，从60％的存活率提高到90％，这种人工喂养条件的优化有力的保障了PEDV感染动物模型建立的物质基础。
　　然后利用已知病毒浓度的病毒液进行了动物实验。对病毒液进行10倍梯度释稀(100～4)，通过对20只健康新生未哺乳仔猪分组处理，选择不同稀释倍数的病毒稀释液对相应组别的实验动物进行人工感染PEDV，通过口服不同稀释度的病毒液10ml感染仔猪，获得不同组别实验动物在攻毒后48h内的发病率，以计算该病毒液的EID50=10-3.5/10ml（表示该病毒悬液作10-3.5稀释后，每头仔猪攻毒10ml可以使50％的猪群感染发病），利用已知浓度换算可知PEDV感染仔猪半数感染量的拷贝浓度为105.12拷贝/uL，此结果对PEDV感染动物模型的推广具有重要的理论意义。
　　最后本研究利用构建的PEDV感染动物模型成功对12头新生仔猪感染PEDV后不同组织脏器带毒情况的探究，通过实验室RT-PCR诊断技术检测发病仔猪不同脏器携带PEDV病毒情况，结果表明PEDV感染仔猪后其肺脏带毒率为0％，肝脏带毒率为63.6％，脾脏带毒率为27.3％，唾液腺带毒率为63.6％％，此结果对今后PED的诊断与防控以及生物安全等领域的研究都具备重要的参考意义。
　　综上所述，本研究通过对PEDV人工感染新生仔猪以及荧光定量RT-PCR标准曲线的绘制，准确测定了PEDV流行毒株半数感染量病毒浓度，同时监测到不同组织脏器在PEDV感染后的带毒情况，本文的研究结果对于今后在PEDV的预防控制、临床诊断、疫苗研发以及生物安全等重要领域具有特殊的参考价值。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

主要缩略语列表

文献综述

1．PEDV病原学研究进展

2．荧光定量PCR技术概述

3．PEDV流行病学概况

4．PED临床症状和病理变化

5．PED诊断方法

6．猪流行性腹泻的治疗和预防

引言

1．材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验样品

1．1．2 实验动物

1．1．3 动物实验器械及材料

1．1．4 主要试剂盒与试剂

1．1．5 主要仪器与设备

1．2．方法

1．2．1 荧光定量PCR测定PEDV病毒浓度方法的建立

1．2．2 动物实验饲养条件的优化

1．2．3 PEDV病毒复壮实验

1．2．4 猪流行性腹泻病毒EID50的测定

1．2．5 RT-PCR检测PEDV感染仔猪后不同脏器带毒率测定

2 结果

2．1 荧光定量PCR检测方法的建立

2．1．1 重组质粒的检测鉴定

2．1．2 PEDV重组质粒浓度测定

2．1．3 荧光定量PCR标准曲线的绘制

2．2 动物实验喂养条件的优化

2．3 PEDV复壮实验

2．3．1 PEDV病毒液实验室检测鉴定

2．3．2 PEDV病毒液序列分析

2．3．3 PEDV病毒液浓度测定

2．4 PEDV动物实验

3．4．1 PEDV病毒液EID50的测定

2．5 实验动物不同组织脏器PEDV带毒检测结果

3．讨论

3．3 PEDV病毒复壮结果

3．4 PEDV EID50测定结果

3．5 PEDV感染仔猪不同组织脏器带毒率测定

4．结论

4．1 PEDV感染动物模型建立

4．2 PEDV感染动物不同组织脏器带毒情况

参考文献

作者简历